吸水链霉菌5008产井冈霉素与黑色素的相关性研究

摘要

井冈霉素(Validamycin A，Val-A)是一种安全高效的抗真菌抗生素。吸水链霉菌5008是常用于工业化发酵生产井冈霉素的放线菌株，使用至今已有40余年。在吸水链霉菌5008发酵过程中，我们发现培养基中同时有一种黑色素产生，且随着发酵时间的延长色素量逐渐增加，是井冈霉素发酵过程中的一种重要副产物。本研究针对该色素与井冈霉素的产生有何相关性进行研究，从井冈霉素产量与色素液吸光值的关系入手，利用qRT-PCR技术，推测两者在代谢通路上的相关性，并将发酵液中的黑色素进行提取，在对色素理化性质及稳定性等研究的基础上，建立了一种Val-A快速检测方法，同时利用FT-IR红外光谱分析等方法对色素物质结构进行初步推测。在提取发酵液中的井冈霉素时，将发酵液中的色素分离出来，可达到对发酵产品更充分的利用，同时也为该色素的开发利用提供理论依据。
　　主要研究结果如下:
　　1.井冈霉素与黑色素产量的关系
　　Val-A的合成与色素的分泌在改变不同发酵条件情况下，如改变培养基、改变发酵温度、添加外源刺激物等，所呈现出的对环境改变的反应趋势是一致的，当处于优势环境中时，两者的合成量共同增加，当处于劣势环境中时，两者的合成量则共同减少。这表明，Val-A的合成与色素的分泌是具有一个稳定的相关性的。
　　2.井冈霉素与黑色素相关基因表达情况
　　针对井冈霉素合成结构基因（valABC, valKLMN, valG）、色素编码基因(SHJG4405)及两个相关的全局调控基因（ugp，afsR）在不同发酵条件下的表达情况进行了研究。当发酵处于劣势环境中，如低产培养基、低温培养等条件，井冈霉素合成结构基因、色素编码基因和两个全局调控基因的表达水平在不同的生长时期均有显著性下降，同样的，在优势环境中，如添加外源刺激物或改变初始pH值条件下，这些基因都会在不同生长时期有不同水平的显著性上调，整体上表现出一种与产量相关的协同性。
　　3.色素理化性质及其稳定性研究
　　本研究从吸水链霉菌5008发酵中将黑色素提取出来，采用光谱法研究了光、温度、pH、还原剂、氧化剂、金属离子和食品添加剂对该色素稳定性的影响。结果表明:该色素具有较好的光、热稳定性和抗紫外辐射能力，具有一定的抗氧化性和抗还原性;pH值对该色素影响较明显，强酸性条件下色素会产生沉淀并变色，中、碱性条件下较稳定;Ca2+、Mn2+、Fe3+对色素的影响较大，Al3+能够对色素起到保色作用，而Mg2+、K+、Na+对色素影响较小;常见食品添加剂蔗糖和葡萄糖能增加色素稳定性，碳酸氢钠、苯甲酸钠对色素稳定性影响较小。
　　4.色素物质结构分析
　　通过与其他天然黑色素红外光谱图进行比较得知，该色素具有黑色素的共性，即基本结构单元是吲哚环，但由于不同来源黑色素某些基团有所差异，结构上存在不同，吸收峰不完全一致。初步判断该色素属于真黑素和棕黑素的混合型黑色素。
　　5.快速检测方法
　　我们将井冈霉素产量与色素吸光值进行关联，确定了两者之间的拟合关系为y=19.410x4-51.750x3+39.262x2+8.604x-0.643，其中x为发酵液的OD450，y为Val-A的浓度，该拟合公式的Adj R-square达到了0.9928，表现出相当高的准确度，在未来工业发展中具有广阔的应用前景。
　　6.一种提高井冈霉素产量的方法
　　本实验利用微生物的群体感应现象，提前向发酵液中添加含群体感应信号分子的发酵上清液，利用群体感应信号分子对其进行刺激，激活群体感应通路的响应，促进相关基因的表达，使得某些次级代谢物的分泌提前进行，提高了次级代谢物井冈霉素的产量。本实验确定了发酵上清液的最适添加时间为发酵开始12h，最适添加浓度为0.5％，96 h发酵培养后，井冈霉素的绝对积累量从12.47 g/L提高到了16.39g/L，在不加大能耗的前提下，该方法能获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本。且使发酵96 h就达到最高产量，发酵提前24 h结束，缩短了发酵周期，取得了更大的生产效率。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 引言

1．1 井冈霉素研究背景

1．1．1 井冈霉素概述

1．1．2 井冈霉素研究历史和现状

1．1．3 井冈霉素合成代谢机制的研究

1．2 天然色素研究概况

1．2．1 天然色素的优点

1．2．2 天然色素的资源

1．2．3 天然色素的应用

1．2．5 天然色素的发展趋势

1．3 微生物产色素研究概述

1．3．1 微生物色素的研究现状

1．3．2 影响微生物色素生物合成的因素

1．4 黑色素研究进展

1．4．1 黑色素概况

1．4．2 黑色素分类

1．4．3 黑色素理化性质

1．4．4 天然黑色素的分离纯化

1．4．5 黑色素的结构研究

1．5 研究内容、目的及意义

1．5．1 研究内容

1．5．2 研究目的及意义

第二章 不同发酵条件下Val-A产量与色素合成关系研究

2．1 材料与仪器

2．1．1 菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 培养基与溶液配制

2．2．2 菌体培养与发酵

2．2．3 井冈霉素产量检测

2．2．4 发酵液中色素吸光值的测定

2．2．5 数据处理及拟合公式与拟合曲线的确定

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 玉米粉培养基中井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．2 大米粉培养基中井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．3 淀粉培养基中井冈毒素产量与色素吸光值的关系

2．3．4 33℃条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．5 添加乙醇条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．6 添加γ-丁内酯条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．7 初始pH 5．0条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．3．8 初始pH 8．0条件下井冈霉素产量与色素吸光值的关系

2．4 Val-A浓度与色素OD值关系的拟合公式确定

本章总结

第三章 不同发酵条件下色素与Val-A相关基因的表达情况

3．1 材料与仪器

3．1．1 菌种

3．1．2 主要试剂

3．1．3 溶液配制

3．1．4 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 RNA提取

3．2．3 cDNA合成

3．2．4 PCR反应

3．2．5 qRT-PCR反应

3．2．6 数据处理与分析

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 引物特异性

3．3．2 不同发酵条件下井冈霉素合成基因的表达水平

3．3．3 不同发酵条件下色素相关基因的表达水平

3．3．4 不同发酵条件下次级代谢调控基因的表达水平

本章总结

第四章 黑色素理化性质研究及结构初探

4．1 材料与仪器

4．1．1 菌种

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 培养基与溶液配制

4．2．2 色素提取

4．2．3 色素吸收光谱分析

4．2．4 色素溶解性研究

4．2．5 色素稳定性的研究

4．2．6 色素红外光谱分析

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 吸水链霉菌5008黑色素的吸收光谱

4．3．2 吸水链霉菌5008黑色素的溶解性

4．3．3 吸水链霉菌5008黑色素的稳定性研究

4．3．4 红外光谱分析

本章总结

第五章 一种提高井冈霉素产量的方法探究

5．1 材料与仪器

5．1．1 菌种

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 培养基与溶液配制

5．2．2 菌体培养与发酵

5．2．3 井冈霉素产量检测

5．2．4 吸水链霉菌5008生物量测定

5．2．5 发酵培养基残糖测定

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 发酵上清液添加时间的确定

5．3．2 发酵上清液添加量的确定

本章总结

第六章 结论与展望

6．1 研究结论

6．2 主要创新点

6．3 不足与展望

参考文献

作者简介