大麦黄矮病毒GAV株系和小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及其应用

摘要

在我国小麦是仅次于水稻的第二大粮食作物，其安全生产关乎民生。近年来，小麦上的病毒病发生较重，尤其是大麦黄矮病毒(Barleyyellow dwarf virus，BYDV)引起的小麦黄矮病和小麦黄花叶病毒(Wheatyellow mosaic virus，WYMV)引起的小麦黄花叶病，造成小麦严重减产和巨大经济损失。目前，侵染我国小麦的小麦黄矮病主要由BYDVGAV株系引起。为了了解这两种病毒病的发生、流行规律、建立早期监测和预警体系，急需建立快速、高效的病毒检测方法。以单克隆抗体为核心建立的血清学检测方法操作简单、特异性好、灵敏度高，且适合田间大规模样品检测，因此被广泛应用于植物病毒的诊断、流行规律的分析、预测预警、科学防控和抗病育种等方面。本论文分别制备了抗BYDVGAV株系和WYMV的单克隆抗体(Monoclonal antibodies，MAbs)，并以单抗为核心建立了相应的血清学检测方法。
　　(1)抗BYDV GAV单克隆抗体的制备及其检测应用:用提纯的BYDV GAV病毒粒子免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆获得8株能稳定传代并分泌抗BYDVGAV单克隆抗体的杂交瘤细胞株（18A1、18A9、12A11、7H11、1G7、1F1、27E1和3F11）。8株杂交瘤细胞分泌的腹水单抗的间接ELISA效价均达到10-6以上，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa链。8株单抗具有特异性好、灵敏度高的特点。以制备的单抗为核心建立了特异性检测BYDV GAV的Antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay(ACP-ELISA)和dot enzyme-linked immunosorbent assay(dot-ELISA)两种血清学方法。建立的血清学方法检测感染BYDV GAV的小麦组织呈特异性阳性反应，而检测感染其他病毒的小麦和健康小麦组织呈阴性反应。用dot-ELISA方法检测携带BYDV GAV的麦蚜呈特异性阳性反应，而检测携带其他病毒的麦蚜和健康麦蚜呈阴性反应。灵敏度分析表明:ACP-ELISA和dot-ELISA检测小麦病叶的灵敏度分别达到1∶81，920和1∶5，120(w/v，g/mL)。利用ACP-ELISA和dot-ELISA两种血清学方法对陕西韩城采集的106株小麦样品进行检测，结果表明106株小麦样品中有64株为BYDV GAV感病样品，说明小麦黄矮病在陕西韩城发生流行。利用dot-ELISA血清学方法对田间采集的280头麦蚜进行检测，结果表明其中有24头蚜虫携带BYDV GAV。
　　(2)抗WYMV单克隆抗体的制备及其检测应用:以提纯的WYMV的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤技术共筛选到3株能稳定传代并分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11、21D4和25B1。3株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-6以上，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa链。Western blot分析表明，4E11和21D4均能与WYMV的外壳蛋白亚基有特异性反应。以制备的单抗为核心建立了检测田间小麦样品中WYMV的ACP-ELISA和dot-ELISA方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA两种方法检测感染WYMV的小麦病叶组织呈特异性阳性反应，而检测感染其他病毒的小麦和健康小麦组织呈阴性反应。ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染WYMV的小麦植物组织的灵敏度分别达到1∶40，960和1∶2，560(w/v，g/mL)。利用ACP-ELISA和dot-ELISA两种血清学方法对山东济宁采集的90株小麦样品进行检测，结果表明90株小麦样品中有39株为WYMV感病样品，说明小麦黄花叶病在山东济宁发生流行。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 大麦黄矮病毒的研究进展

1．1 寄主范围、传播介体及传播方式

1．2 病害症状和分布

1．3 大麦黄矮病毒的株系划分

1．4 大麦黄矮病毒的分子生物学特征

1．5 大麦黄矮病毒的检测技术

1．6 防治策略

2 小麦黄花叶病毒的研究进展

2．1 发生分布与危害

2．2 症状特点

2．3 发病规律

2．4 小麦黄花叶病毒的分子生物学特征

2．5 小麦黄花叶病毒的检测技术

2．6 防治策略

3 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用

3．1 抗体的结构及其特性

3．2 单克隆抗体杂交瘤技术

3．3 单克隆抗体在植物病毒学中的应用

第二章 大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体的制备和应用

1 材料与方法

1．1 病毒材料、培养基和抗体

1．2 大麦黄矮病毒GAV的提纯

1．3 单克隆抗体的制备

1．4 BYDV GAV单抗的Western blot分析

1．5 血清学方法的建立及单抗的特性分析

1．6 检测BYDV GAV的RT-PCR方法

2 实验结果及分析

2．1 大麦黄矮病毒GAV的提纯及抗原制备

2．2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆

2．3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2．4 BYDV GAV单抗的Western blot分析

2．5 ACP-ELISA方法的建立及其应用

2．6 dot-ELISA方法的建立及其应用

3 讨论

第三章 小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

1 材料与方法

1．1 病毒材料、培养基和抗体

1．2 小麦黄花叶病毒的提纯

1．3 杂交瘤细胞的制备

1．4 腹水制备和抗体纯化

1．5 抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定

1．6 WYMV单抗的Western blot分析

1．7 单抗特性的分析及检测WYMV血清学方法的建立

1．8 建立的ACP-ELISA和dot-ELISA血清学方法的田间应用

1．9 检测WYMV的RT-PCR方法

2 实验结果与分析

2．1 小麦黄花叶病毒的提纯

2．2 细胞的融合、杂交瘤的筛选和克隆

2．3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2．4 单抗的Western blot分析

2．5 ACP-ELISA的建立及应用

2．6 dot-ELISA的建立及其应用

3 讨论

参考文献

附录

在学期间所取得的科研成果