小麦矮缩病毒和大麦黄矮病毒PAV株系基于单克隆抗体的血清学检测技术

摘要

小麦是世界上最主要的粮食作物，但其生产却一直饱受各种病原体侵染的影响，其中之一的病毒病原是影响小麦产量和质量的重要因素。目前巳报道50多种植物病毒可以侵染危害小麦，其中由小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)引起的小麦矮缩病和大麦黄矮病毒(Barleyyellow dwarf viruses，BYDVs)引起的小麦黄矮病在我国小麦种植区分布广泛，每年均造成较大的产量损失。建立快速、准确、高通量的病毒检测技术是植物病毒流行病学研究、抗病育种及科学防控的关键。而以单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术操作简单、特异性好、灵敏度高，且适合大规模样品检测，因此被广泛应用于植物病毒的诊断和检测中，是目前植物病毒最主要的检测技术。但迄今为止，国内外未见以WDV和BYDVPAV株系单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术的应用报道。为此，本论文制备了多株分别抗WDV和BYDV PAV株系的单克隆抗体，并以单克隆抗体为核心分别建立了这两种病毒的高度特异和灵敏的血清学检测技术，从而为这两种病毒病的诊断与检测、预测预警和科学防控体系的建立提供技术支持。
　　(1)抗WDV单克隆抗体的制备及其检测应用:将WDV的外壳蛋白(CP)基因克隆到原核表达载体pET-32a的多克隆位点中构建成重组原核表达载体pET-32a-CP，并在大肠杆菌中成功表达。表达的重组蛋白通过Ni2+-NTA agarose纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术获得了4株能够稳定传代并分泌抗WDV单抗的杂交瘤细胞株(18G10、9G4、23F4和22A10)。4株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接ELISA效价均达到10-6以上，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。Western blot分析发现，4株单抗均能与WDV的CP发生特异性免疫反应，而不与任何小麦植物蛋白反应。根据血清学原理，以制备的单抗为核心建立了检测WDV的ACP-ELISA和dot-ELISA的血清学方法。其中，以23F4、22A10单抗为核心建立的ACP-ELISA方法的灵敏度较高，检测WDV病叶的灵敏度可以达到1∶163840倍稀释(w/v, g/mL)，而以9G4、18G10单抗为核心建立的ACP-ELISA方法的灵敏度也可达到1∶81920倍稀释(w/v, g/mL);以23F4单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度最高，检测WDV病叶的灵敏度达到1∶5120倍稀释(w/v, g/mL)，以22A10、18G10单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度也可达到1∶1280倍稀释(w/v, g/mL)，而以9G4单抗为核心建立的dot-ELISA方法的灵敏度最低，为1∶640倍稀释(w/v,g/mL)。用建立的血清学方法对采自陕西省和青海省的128个田间小麦样品进行检测，检测结果发现，有79个样品感染WDV，且血清学方法的检测结果与PCR检测结果完全符合。PCR产物测序和序列比对证明，血清学方法检测到的阳性样品确实感染WDV。
　　(2)抗BYDV PAV单克隆抗体的制备及其检测应用:将BYDV PAV病毒粗提液作为免疫原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术获得了6株能够分泌抗BYDVPAV单抗的杂交瘤细胞株(6C4、24G4、25C2、15A12、19G7和18C2)。6株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接ELISA效价均达到10-6以上，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。以制备的单抗为核心建立了检测BYDV PAV的ACP-ELISA和dot-ELISA两种血清学方法。其中建立的ACP-ELISA方法检测感染BYDV PAV小麦病叶的灵敏度最高可达到1∶163840倍稀释(w/v, g/mL)，而与BYDV GAV株系、BYDVGPV株系、WDV、小麦黄花叶病毒(Wheatyellow mosaic virus，WYMV)、大麦黄花叶病毒(Barleyyellow mosaic virus，BaYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)感染的小麦植物样品和健康小麦组织呈阴性反应;建立的dot-ELISA方法检测感染BYDV PAV小麦病叶的灵敏度最高可达到1∶2560倍稀释(w/v, g/mL)，而与检测的麦类其他病毒和健康小麦植物组织呈阴性反应。用建立的两种方法对采自陕西省和青海省的135个田间小麦样品进行检测，结果发现有88个样品感染BYDV PAV，且检测结果与RT-PCR的检测结果完全一致。PCR产物测序和序列比对证明，两种血清学检测方法检测到的阳性样本中确实感染BYDV PAV病毒。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 小麦矮缩病毒的研究进展

1．1 寄主范围与侵染症状

1．2 发生与分布

1．3 传播介体

1．4 发病规律

1．5 病毒粒子形态和株系划分

1．6 病毒的分子生物学特征

1．7 小麦矮缩病毒检测技术

1．8 防治措施

2 大麦黄矮病毒的研究进展

2．1 症状特点、寄主范围及传播方式

2．2 病毒分类地位与株系划分

2．3 病毒粒子形态和生化特性

2．4 发生与分布

2．5 基因组结构与功能

2．6 传播介体

2．7 大麦黄矮病毒的检测方法

2．8 防治措施

3 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用

3．1 抗体的结构及特性

3．2 单克隆抗体技术

3．3 单克隆抗体在植物病毒学中的应用

4 研究目的和意义

第二章 小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用

1 材料与方法

1．1 病毒材料、菌株和质粒

1．2 培养基、抗体及实验材料

1．3 WDV CP的原核表达

1．4 WDV CP蛋白的表达及纯化

1．5 单克隆抗体的制备

1．6 血清学方法的建立及特性分析

1．7 血清学方法的田间应用

2 结果与分析

2．1 WDV CP的原核表达和纯化

2．2 细胞的融合、筛选和克隆

2．3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2．4 Western blot分析WDV单抗的特异性

2．5 ACP-ELISA方法的建立及其特性分析

2．6 dot-ELISA方法的建立及其特性分析

2．7 血清学方法的田间应用

3 讨论

第三章 大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的制备及其应用

1 材料与方法

1．1 病毒材料

1．2 培养基、抗体及实验材料

1．3 免疫原的制备

1．4 单克隆抗体的制备

1．5 Western blot分析单抗的特性

1．6 血清学方法的建立及特性分析

1．7 RT-PCR方法检测BYDV PAV

1．8 血清学方法的田间应用

2 结果与分析

2．1 细胞的融合、杂交瘤的筛选和克隆

2．2 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2．3 Western blot分析BYDV PAV单抗的特异性

2．4 ACP-ELISA方法的建立

2．5 dot-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度分析

2．6 血清学方法的田间应用

3 讨论

全文总结

参考文献

附录