分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用差速离心的方法提纯的大麦黄矮病毒（BYDV）GAV株系病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗BYDVGAV单克隆抗体的杂交瘤细胞株27E1，其保藏号为CGMCCNo.8781。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价达10

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。 

背景技术

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus ,BYDV）引起的，该病害在全世界均有分布，它的寄主广泛，可寄生150多种单子叶植物，特别是侵染大麦、小麦、燕麦、水稻等多种禾谷类作物。1950年在美国加利福尼亚州的大麦上首先发现，是世界上危害最严重、流行最广泛的植物病毒之一。我国于1960年在陕西、甘肃的小麦上发现，是小麦最重要的病毒病害，被称为小麦的“黄色瘟疫”，“小麦癌症”。目前主要分布在西北、华北、东北、华中、西南及华东等冬麦区、春麦区及冬春麦混种区，除危害小麦外，还能侵染大麦、莜麦、粟、糜子、玉米、水稻和禾本科杂草。受害小麦一般减产40%左右，严重的可达70%以上。我国20世纪60年代以来，曾于1966、1968、1970、1973、1978、1980和1987年大流行。在陕西、甘肃、宁夏、山西和内蒙古等省、自治区造成小麦严重减产。这类病毒除了在经济上的重要性外，它们的基因表达机制、进化与传播介体和寄主的作用机制，几十年来一直被研究者所关注。 

小麦黄矮病的症状因寄主种类、品系、生长期及生理条件、病毒株系、接种剂量和环境条件等因素的不同而有差异。寄主植物受黄矮病毒侵染后，苗期感病植株生长缓慢、分蘖减少、扎根浅、易拔起。病叶自叶尖褪绿变黄，叶片厚硬。病株越冬期间易被冻死，未冻死的返青拔节后新生叶片继续发病。病株矮化、不抽穗或抽的穗很小。拔节孕穗期感病的植株较矮，根系发育不良。典型症状是新叶从叶尖开始发黄，随后出现与叶脉平行，但不受叶脉限制的黄绿相间的条纹，沿叶缘向叶茎部扩展蔓延，黄化部分约占全叶的1/3-1/2。病叶质地光滑，后期逐渐黄枯，而下部叶片仍为绿色。病株能抽穗，但籽粒秕瘦。穂期感病的植株一般只旗叶发黄，呈鲜黄色，植株矮化不明显，能抽穗，粒重降低。大麦幼苗期感病后严重矮缩，分蘖增多，叶片变硬发脆，叶尖开始变黄，呈鲜艳的金黄色或橙色，有光泽，不抽穗或抽的穂很小，籽粒很少，且不饱满。拔节期感病，节间缩短，植株显著矮化，分蘖增多，叶片呈金黄色。抽穗后感病，一般只旗叶呈金黄色，矮化较轻，能抽穂，籽粒秕瘦。 

大麦黄矮病毒是一类+ssRNA病毒。BYDV为对称球型病毒，外壳为二十面体（T=3），无包膜。由蚜虫以循佪型持久传播，病毒粒体在蚜虫体内不增殖，不能通过摩擦接触接种。不同种的病毒蚜传特性不同，即总是每一种病毒对应一种或几种蚜虫传播介体。病毒在植物体内仅限于韧皮部组织，并且在寄主体内浓度很低。 

世界上引起麦类作物黄矮病的病毒隶属于黄症病毒科的黄症病毒属，目前已知的有病毒PAV、MAV、SGV、RPV、RMV 以及我国特有的GAV和GPV。其中PAV、MAV是黄症病毒属的正式成员，禾谷黄矮病毒RPV被分在马铃薯卷叶病毒属，SGV、GAV、GPV、和RMV还未正式命名。 

大麦黄矮病毒的侵染循环在冬麦区、冬春麦混种区是有差异的。冬麦区如陕、甘、豫、鲁、冀、皖、苏等省在5月中下旬，传毒介体麦蚜从小麦寄主上迁出，在越夏寄主上取食、繁殖和传播病毒。越夏寄主包括玉米、高粱、糜子、粟（谷子）、水稻等作物以及自生麦苗、鹅观草、野燕麦、雀麦、画眉草、白羊草、马唐、蟋蟀草、虎尾草等禾本科杂草。秋季小麦出苗后，麦蚜又迁回麦地，特别是田边的小麦上取食、繁殖和传播病毒，并以有翅成蚜、无翅成蚜和若蚜在麦田基部越冬，有些地区也产卵越冬。冬前感病的小麦是第二年早春的发病中心。返青后，在拔节期出现一次发病高峰。发病中心的病毒随着麦蚜的迁移扩散逐渐蔓延，到抽穗期出现第二次发病高峰。 

冬、春麦混种区如甘肃河西走廊一带，5月中旬，冬小麦上的麦蚜逐渐产生有翅蚜，向春小麦、大麦、高粱、糜子及禾本科杂草上迁移。晚熟春麦、糜子和自生麦苗是蚜虫和大麦黄矮病毒的主要越夏场所。9月下旬，冬小麦出苗后，麦蚜又迁回麦田，在冬小麦上产卵越冬，小麦黄矮病毒也随之传到冬小麦麦苗上，在冬小麦根部和分蘗节里越冬。第二年3月中旬，越冬蚜卵开始孵化，4月中旬产生有翅蚜，迁移扩散，不断地传播病毒。 

小麦黄矮病在春麦区的侵染循环比较复杂。据1965年以来的历年调查表明，豫西、关中、晋南、陇东等冬麦区的麦蚜和小麦黄矮病与宁夏、内蒙古等春麦区的麦蚜和小麦黄矮病发生流行趋势基本一致，说明春麦区的虫源、毒源有可能来自部分冬麦区。实际调查表明，麦蚜能够凭借气候条件，从冬麦区迁飞至春麦区，并传播病毒，成为春麦区小麦黄矮病的初侵染源和毒源。有翅蚜迁入的主要气候形势为“槽前锋后”型，迁入区域主要为西起宁夏黄灌区，包括内蒙古巴彦卓尔盟、伊克昭盟、乌兰察布盟及河北张家口，承德和西北部春麦区。迁出区域主要是豫西、关中、晋南、陇东、陇南和延安等冬麦区。在小麦病毒病的防治上，传统的是采取推广抗病品种、轮作和治虫防病等措施。 

本发明主要针对大麦黄矮病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前小麦黄矮病的发生规律和防控技术上有很多工作急需开展，预测预报和监测体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要是田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。目前国内外未研制出针对这种病毒的特异性的单克隆抗体。因此，本专利利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗BYDV GAV株系单抗的杂交瘤细胞，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒。 

以大麦黄矮病毒病为对象，制备针对大麦黄矮病毒的单克隆抗体，建立高效、快捷的病毒检测方法和检测试剂盒，建立相关病害的预测预报技术体系和早期预警平台，保证我国小麦的稳产增收。 

本发明以BYDV GAV株系的提纯病毒粒子为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗BYDV GAV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，以其分泌的单抗为核心建立了检测BYDV GAV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间小麦黄矮病的检测，从而为我国小麦黄矮病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。 

分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株27E1，它能分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体，杂交瘤细胞株27E1 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8781，。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体腹水dot-ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体能与大麦黄矮病毒GAV株系有特异性反应，而不与芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和PAV株系发生免疫反应。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。 

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株27E1分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测大麦黄矮病毒-GAV株系；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测大麦黄矮病毒GAV株系，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的大麦黄矮病毒GAV株系的检测、诊断。 

附图说明

图1 是dot-ELISA方法检测大麦黄矮病毒GAV株系的灵敏度分析； 

图2 是dot-ELISA方法检测田间小麦样品中大麦黄矮病毒GAV的结果;

生物保藏

杂交瘤细胞株27E1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2014年1月22日，保藏号为CGMCC No.8781。

具体实施方式

分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株27E1，保藏于中国科学院微生物研究所 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8781，它能分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体腹水dot-ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系的单克隆抗体能与大麦黄矮病毒GAV株系有特异性反应，而不与芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和PAV株系发生免疫反应。 

抗大麦黄矮病毒GAV株系单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。 

本发明提供的杂交瘤细胞株27E1能大量分泌抗大麦黄矮病毒GAV株系单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测BYDV GAV株系的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间BYDV GAV株系的检测，从而为我国大麦黄矮病毒早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。 

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。 

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备 

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯病毒粒子：

1） 将大研钵和组织搅拌器预冷；

2）燕麦毒源于液氮中研磨成粉末 重量1kg；

3）以1：2 （w/v，g/ml）的比例加入0.1M磷酸盐缓冲液（即PB缓冲液）2000ml（含1%（v/v）巯基乙醇和5g崩溃酶），搅拌60秒混匀。以后每隔15分，搅拌30秒，匀浆3小时；

4） 加入Triton X-100至终浓度为0.5% （v/v），室温搅拌30分钟；

5）4到6层纱布过滤，滤液体积2100ml，加入1/5体积的氯仿：正戊醇（2：1, v/v）420ml；

6）加盖搅拌30分钟；

7）8000rpm离心15分钟，取上清；

8）量取上清体积，先加入NaCl至0.25M,然后，慢慢加入PEG 6000至终溶度为10%（w/v, g/ml）的，即上清体积2200ml加NaCl 35g,PEG 6000 220g；

9）溶解后冰浴放置90-120分钟。

10）10000rpm离心20分钟，弃上清，去净残液后倒扣于吸水纸上10分钟，加入30ml 0.1M PB悬浮沉淀,4℃搅拌过夜； 

11）5000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清加到50ml厚壁离心管中30%的蔗糖 （溶于0.1M PB中）垫上，蔗糖垫体积15ml；

12）Beckman Ti55型转头44,000rpm离心2小时；

13）弃上清，沉淀溶于3ml 0.1M PB中， 4℃用搅拌悬浮过夜，悬浮液即为病毒提纯粒子；

14）电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的大麦黄矮病毒粒子。

2.免疫动物 

用提纯的大麦黄矮病毒GAV株系的病毒粒子免疫四周龄体重18-20g BALB/c 雌性小鼠。即大麦黄矮病毒GAV株系的病毒粒子100μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合 

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按7：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆 

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以感染BYDV GAV病毒的小麦叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获72个阳性孔。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗BYDV GAV的特异性单抗的杂交瘤细胞株27E1。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测 

用感染芜菁花叶病毒（TuMV）、番茄花叶病毒（ToMV）、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒(PVY)、水稻矮缩病毒（RDV）、水稻条纹病毒（RSV）、水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）、中国小麦花叶病毒（CWMV）、小麦黄花叶病毒（WYMV）、大麦黄花叶病毒（BaYMV）、小麦黄矮病毒(BYDV) GPV株系和PAV株系的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以大麦黄矮病毒 GAV株系为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃ 2小时使其吸附于ELISA板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉或1％ BSA或3％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时；PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，27E1单抗对BYDV GAV有特异性反应，而与TuMV、TMV、ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、RRSV、CWMV、WYMV、BaYMV、BYDV GPV和PAV病毒及健康植物均无免疫反应。

  

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06 M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定 

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG1、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为27E1单抗亚类为IgG1、kappa链。用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，检测结果表明上述单抗腹水效价在10－6以上。

二、病毒免疫学检测方法及其检测试剂盒 

1. dot-ELISA方法的建立及其检测应用

将小麦叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测小麦病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明27E1单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:3000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测BYDV GAV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当小麦叶片稀释到1:640倍（w/v, g/mL）时，以27E1单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:640倍稀释（图1）。 

用建立的dot-ELISA方法对2013年采自田间小麦样品进行检测，结果发现，23个样品中有14个样品产生紫色的阳性斑点（图2）。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到BYDV GAV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染BYDV GAV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于小麦样品中BYDV GAV的检测。 

  

2.以单抗为核心建立的抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

 ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，以BYDV GAV小麦病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性， 或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

 ACP-ELISA方法检测灵敏度检测 

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释，以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～2560倍稀释的病叶汁液呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：2560，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

3.检测BYDV GAV的TAS-ELISA检测方法 

TAS-ELISA 方法的操作流程：

1) 1:5000倍稀释的抗BYDV GAV的兔抗血清（由纯化的原核表达BYDV GAV-CP免疫兔子制备）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min 

3)加入检测样品100ul/孔。以BYDV GAV病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37℃ 1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃ 1-2h

6)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定： 

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗BYDV GAV血清；加入BYDV GAV 病叶汁；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）按1﹕10000倍稀释；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果表明BYDV GAV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕10000、1﹕5000。

TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定 

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将BYDV GAV病叶汁用PBS液进行倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，测定结果为：TAS-ELISA 检测病叶的灵敏度分别达到1:12000倍稀释（w/v, g /mL），说明本方法具有很好的灵敏度。

4.大麦黄矮病毒dot-ELISA检测试剂盒 

1）试剂盒主要成分：

BYDV GAV 单克隆抗体1管                                 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗  1管                             0.1 ml

NBT/BCIP底物 各1瓶                            分别为2 ml和1ml

阳性对照 （含BYDV GAV小麦叶汁）   1管                2 ml

 阴性对照（健康小麦叶汁）             1管                  2 ml   

抗体稀释液 （10X） 1瓶                                  80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张                                 

2）检测小麦样品的操作步骤：

a.将小麦叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min; 

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min; 

g. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）保存及有效期 

    于2～8℃避光保存，有效期12个月。

  

4）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl                                               8 g

KCl                                              0.2 g

KH2PO4                                        0.2 g

Na2HPO412H2O                            3g

叠氮化钠                                          0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。