噻吩骈吡啶酮及2-氨基嘧啶类Chk1抑制剂的设计、合成及生物学活性评价

摘要

恶性肿瘤已成为我国居民的第一大致死疾病。近年来，虽有不少分子靶向抗肿瘤药物进入临床应用，但由于肿瘤的复杂性、遗传的多样性，单一靶向药物并不足以治愈肿瘤。传统的DNA损伤药物虽能延长肿瘤患者的生存期，但因其选择性差、可引起多种严重的毒副作用而限制了其在临床上的应用。因此，开发细胞周期相关药物及其与DNA损伤药物联合用药的策略已成为抗肿瘤药物研发的热点之一。
　　本论文根据文献报道的细胞周期检查点激酶1(Chk1)抑制剂的结构特征及其与Chk1蛋白的结合模式，应用生物电子等排原理，设计合成了28个噻吩骈吡啶酮类衍生物。体外Chk1抑制活性结果表明:大部分化合物显示出中等到强的Chk1抑制活性。其中，10个化合物的IC50值小于10nM，并讨论了其构效关系。同时，部分化合物对相关激酶具有较好的选择性。3个代表性化合物1-65，1-68及1-71单独用药未表现出明显的细胞毒性，但均能显著增强DNA损伤药物美法仑对RPMI-8226细胞株的增殖抑制活性。
　　在新一轮的结构改造过程中，结合文献报道的另一个吲哚-喹啉酮类化合物2-1，采用骨架迁越的原理，初步设计合成了4个3-吲哚吡啶酮类化合物，并进行了体外Chk1抑制活性测试。遗憾的是这4个化合物对Chk1激酶均没有明显的抑制作用。在对化合物2-22进行其它激酶靶点(IKKβ、CDK2/cyclinA、AuroraA及PKC)的活性筛选过程中发现，其具有一定的AuroraA抑制作用(IC50=1.23μM)。
　　为寻找全新母核结构的Chk1抑制剂，我们采用计算机辅助药物设计技术构建了基于晶体结构的Chk1抑制剂的虚拟筛选模型。在利用该模型对Chembridge数据库及实验室内部化合物库进行虚拟筛选的基础上，结合生物活性测试，发现了对Chk1具有中等抑制活性的N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物MCL1020。进而根据其结构特征，结合骨架迁越等理性药物设计方法对MCL1020进行了结构优化，设计合成了62个N-取代吡啶/嘧啶-2-氨基嘧啶类衍生物。Chk1抑制活性测试结果表明:大部分化合物显示出中等到强的Chk1抑制活性。其中，25个化合物的IC50值小于10nM。4个代表性化合物分别与Gemcitabine联合用药均能显著增强Gemcitabine对SW620细胞株的增殖抑制活性。Western blotting实验结果表明，化合物3-94在0.1和0.5μM浓度下均能抑制Gemcitabine诱导的Chk1蛋白(S296)的磷酸化。对10个Chk1抑制活性较好的化合物进行了体外5种不同的血液肿瘤细胞株的增殖抑制作用筛选，发现该类化合物对人急性髓系白血病MV-4-11细胞株具有较强的增殖抑制作用，与阳性对照AZD7762活性相当，并对其它4种肿瘤细胞株表现出了一定的选择性。为考察该类化合物的成药性，对4个代表性化合物进行了体外鼠肝微粒体稳定性及MDCK跨膜转运能力测试，结果表明，4个化合物在鼠肝微粒体中稳定，且具有良好的透膜能力。
　　综合体外抑酶及肿瘤细胞增殖抑制活性评价的结果，选取化合物3-209进行了人急性髓系白血病MV-4-11Ba1b/c裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用测试。结果显示，该化合物具有显著的抑制白血病肿瘤组织生长的能力，抑瘤率达83.81％，且受试动物体重未见明显下降。对化合物3-94和3-209的初步药代动力学性质评价结果表明，化合物3-209口服无吸收，但化合物3-94具有一定的口服生物利用度(F=37％)，且静脉注射给药后表现出了更好的药代动力学性质，为进一步体内药效学评价及后续作用机制的研究奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

1 噻吩骈吡啶酮类Chk1抑制剂的设计、合成及生物活性评价

1．1 研究背景

1．2 噻吩骈吡啶酮类衍生物的设计思路

1．3 噻吩骈吡啶酮类衍生物的合成

1．3．2 噻吩[2，3-b]吡啶酮类衍生物的合成

1．3．3 噻吩[3，2-b]吡啶酮类衍生物的合成

1．4 噻吩骈毗啶酮类衍生物的体外生物学评价及构效关系讨论

1．4．1 噻吩骈吡啶酮类衍生物的Chk1抑制活性及初步构效关系讨论

1．4．2 噻吩骈吡啶酮类衍生物与美法仑联合用药对细胞增殖抑制的协同作用

1．4．3 噻吩骈吡啶酮类化合物对相关激酶的选择性

1．5 噻吩骈吡啶酮类衍生物与Chk1蛋白的分子对接研究

1．6 小结

1．7 实验部分

1．7．1 化学合成

1．7．2 噻吩骈吡啶酮类衍生物的Chk1激酶抑制活性测试

1．7．3 噻吩骈吡啶酮类衍生物与美法仑联合用药对细胞增殖抑制的协同作用测试

1．7．4 噻吩骈吡啶酮类化合物对相关激酶的选择性测试

1．7．5 噻吩骈吡啶酮类衍生物与Chk1蛋白的分子对接

参考文献

2 3-吲哚吡啶酮类Chk1抑制剂的设计、合成及生物活性评价

2．2 3-吲哚吡啶酮类衍生物的合成

2．2．1 吲哚片段的合成

2．2．2 吲唑片段的合成

2．3 3-吲哚吡啶酮类衍生物的体外生物学活性评价

2．3．2 3-吲哚吡啶酮类衍生物对其它激酶的抑制活性筛选

2．4 3-吲哚吡啶酮类衍生物与Chk1蛋白的分子对接

2．5 小结

2．6 实验部分

2．6．1 化学合成

2．6．2 3-吲哚吡啶酮类衍生物的Chk1激酶抑制活性测试

2．6．3 3-吲哚吡啶酮类衍生物对其它激酶的抑制活性测试

2．6．4 3-吲哚吡啶酮类衍生物与Chk1蛋白的分子对接

参考文献

3 N-取代吡啶／嘧啶-2-氨基嘧啶类Chk1抑制剂的设计、合成及生物活性评价

3．1 研究背景

3．2．1 训练集数据库的构建

3．2．2 分子对接

3．2．3 打分函数的选择

3．2．4 虚拟筛选结果

3．2．5 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶化合物MCL1020与Chk1蛋白的分子对接

3．3 N-取代吡啶／嘧啶-2-氨基嘧啶类Chk1抑制剂的设计

3．4 N-取代吡啶／嘧啶-2-氨基嘧啶类Chk1抑制剂的合成

3．4．1N2-取代吡啶／嘧啶-N4-脂肪胺基-2，4-二氨基嘧啶衍生物的合成

3．4．2 5-(4-甲基噻唑基)-N2-取代吡啶-N4-脂肪胺基-2，4-二氨基嘧啶衍生物的合成

3．4．3 5-芳环／芳杂环基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成

3．4．4 5-芳环／芳杂环基-4-甲氧／甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成

3．4．5 5-(4-甲基噻唑基)-4-甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物3-220的合成

3．5 N-取代吡啶／嘧啶-2-氨基嘧啶类衍生物的体外生物学活性评价及构效关系讨论

3．5．1 N-取代吡啶／嘧啶-2-氨基嘧啶类衍生物的Chk1抑制活性及构效关系讨论

3．5．2 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物与吉西他滨(Gemcitabine)联合用药对SW620细胞增殖抑制的协同作用

3．5．3 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物对Chk1蛋白磷酸化的抑制作用

3．5．4 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物对血液肿瘤细胞株的增殖抑制活性及初步构效关系讨论

3．5．5 鼠肝微粒体稳定性测试

3．5．6 MDCK跨膜转运能力测试

3．6 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物的体内生物学活性评价

3．7 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物的体内药代动力学评价

3．8 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物与Chk1蛋白的分子对接研究

3．9 小结

3．1 0实验部分

3．10．1 基于结构的Chk1抑制剂虚拟筛选模型的构建

3．10．2 化学合成

3．10．3 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物的体外Chk1抑制活性测试

3．10．5 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物对Chk1蛋白磷酸化的抑制作用测试

3．10．6 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物对血液肿瘤细胞株的增殖抑制活性测试

3．10．7 鼠肝微粒体稳定性测试

3．10．8 MDCK跨膜转运能力测试

3．10．9 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物对MV-4-11 Ba1b／c小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用测试

3．10．10 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物的体内药代动力学测试

3．10．11 N-取代吡啶-2-氨基嘧啶类衍生物与Chk1蛋白的分子对接

参考文献

4 抗肿瘤Chk1抑制剂的研究进展(综述)

4．1 细胞周期检查点激酶(CHK)的结构、功能及相关信号通路

4．2 Chk1抑制剂的作用方式

4．3 小分子Chk1抑制剂的分类和研究进展

4．3．1 天然产物及其类似物

4．3．2 二芳基脲类衍生物

4．3．3 噻吩类衍生物

4．3．4 三唑酮类衍生物

4．3．5 吡咯并嘧啶类衍生物

4．3．6 咪唑并吡嗪类衍生物

4．3．7 吲哚吲唑类衍生物

4．3．8 喹啉酮类及噻吩骈吡啶酮类衍生物

4．3．9 吲唑及吡唑类衍生物

4．3．10 噻唑甲酰胺类衍生物

4．3．11 吡啶-2-氨基噻唑类衍生物

4．3．12 吲哚酮类衍生物

4．3．13 苯并二氮杂酮类衍生物

4．3．14 三环及四环类衍生物

4．3．15 呋喃并嘧啶及吡咯并嘧啶类衍生物

4．3．16 二氮杂吲哚酮类衍生物

4．3．17 吡啶-2-氨基吡嗪类衍生物

4．3．18 二氮杂咔唑类衍生物

4．3．19 变构抑制剂

4．4 ATP竞争性小分子Chk1抑制剂的药效因素及结构特征

4．5 进入临床研究的Chk1抑制剂

4．6 小结与展望

参考文献

作者简历