基层医疗机构大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌氟喹诺酮耐药分子流行及遗传特征研究

摘要

氟喹诺酮是一类人工合成药物，抗菌谱广，是临床使用最广泛的一类抗菌药物，其耐药也尤为突出。自20世纪90年代以来，我国呈现出大肠埃希菌高频耐药(64.5％-71.8％)现象，有关耐药调查以及机制研究大多集中在中心城市三级医院，县级医院及社区感染细菌耐药研究极少，开展县级医疗机构社区感染患者细菌对喹诺酮类的耐药研究，有助于指导这类医疗机构感染治疗和抗菌药物合理使用。
　　本研究第一部分收集来自全国七个地区30家县级医院社区感染非重复大肠埃希菌590株，肺炎克雷伯菌569株。细菌体外药敏试验检测其对17种抗菌药物的敏感性;PCR方法检测质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因:qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，aac(6')-Ib-cr，qepA和oqxAB及喹诺酮耐药决定区(QRDR)DNA旋转酶gyrA，gyrB亚基和拓扑异构酶Ⅳ parC，parE亚基突变，采用DNASTAR软件分析测序结果，突变比较参照E.coli k-12和Klebsiellapneumoniae MGH78578;对非QRDR介导耐药菌株进行外排泵抑制试验。
　　试验结果显示590株大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率为51.2％，PMQR基因检出率为37.3％，qnr类的流行率为3.7％，aac(6')Ib-cr19.7％，qepA14.1％，oqxAB3.9％。24株同时携带2种以上PMQR基因。环丙沙星耐药组100％存在QRDR突变，93.7％是3个以上位点突变;敏感组66.7％存在QRDR突变。569株肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药率为8.3％，PMQR检出率为70.0％，qnr类流行率为36.6％，aac(6') Ib-cr9.1％，qepA43.8％。环丙沙星耐药组73.9％存在QRDR突变，19.6％是3个以上位点突变。敏感组4％存在QRDR突变。12株(26.1％)肺炎克雷伯菌为非QRDR介导耐药，环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)可被外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)降为敏感水平。
　　分子流行病学研究发现，县级医院社区感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌氟喹诺酮耐药率相差悬殊(51.2％ versus8.3％)，原因除肺炎克雷伯菌氟喹诺酮耐药率相比大肠埃希菌长期处于较低水平外，还与肺炎克雷伯菌24.5％（大肠埃希菌9.9％）来自0-14岁儿童有关，该组环丙沙星的耐药率仅为4.2％。大肠埃希菌在耐药组(100％)甚至敏感组(66.7％)都有很高的QRDR突变率，对QRDR突变的积累明显高于肺炎克雷伯菌（耐药组73.9％，敏感组4％）。
　　本研究第二部分对302株环丙沙星耐药大肠埃希菌和46株环丙沙星耐药肺炎克雷伯菌遗传特征及多PMQR菌株耐药质粒传播特征进行研究。大肠埃希菌MLST分型选用UCC数据库(http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli)，肺炎克雷伯菌MLST分型选用pasteur数据库(http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。测序结果在数据库中在线比对，获得等位基因型和序列型(ST)。氟喹诺酮耐药菌株遗传进化分析采用eBURST V3和商业化Bionumerics软件。多PMQR耐药质粒复制子分型采用基于PCR的分型方法PBRT+ColE+IncR，可对肠杆菌科20种常见复制子进行分型。并对这些多PMQR耐药质粒进行接合传播试验。
　　试验结果显示302株环丙沙星耐药大肠埃希菌共有60种ST型。常见流行型为ST131(14.6％), ST1193(7.9％), ST405(6.6％), ST69(6.3％), ST648(6.3％)。华东、中南、华北、东北、西北、华南和西南地区分别有15、26、28、11、17、22和13种。46株环丙沙星耐药肺炎克雷伯菌共有23种ST型。克隆复合体CC11(ST11，ST340，AT258)占15.2％，其次为ST1(13.0％)，ST15(10.9％)，ST147(10.9％)和ST875(8.7％)。华东、中南、华北、东北、西北、华南和西南地区分别有3、2、5、4、8、5和7种。大肠埃希菌多PMQR耐药质粒复制子83.3％为IncF，大多与其他复制子共存，45.8％可接合转移耐药基因。肺炎克雷伯菌多PMQR耐药质粒复制子70％为ColE-like，75％可接合转移耐药基因。
　　本研究通过第二部分耐药氟喹诺酮遗传特征分析和多PMQR耐药质粒复制子分型和传播特征研究发现氟喹诺酮耐药大肠埃希菌序列型多样，在各地区呈散在分布，没有暴发流行克隆型。肺炎克雷伯菌虽然仅46株对环丙沙星耐药，但序列型也很丰富，达23种。也呈散在分布，无克隆传播趋势。说明大肠埃希菌氟喹诺酮耐药菌株呈多点起源，散在分布。
　　本研究通过对中国七个地区30家县级医院社区感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌氟喹诺酮耐药分子流行及遗传特征研究发现:大肠埃希菌对氟喹诺酮高频耐药，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对QRDR突变积累存在差异可能是两者耐药率悬殊的一个重要影响因素。氟喹诺酮耐药菌株呈多点起源，散在分布。高氟喹诺酮耐药水平是长期耐药基因突变积累的结果，非优势克隆传播引起。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌对氟喹诺酮耐药分子流行病学研究

引言

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 试剂和仪器

2 研究方法

2．1 细菌体外药敏试验

2．2 PCR方法检测喹诺酮耐药基因

2．3 非QRDR介导的氟喹诺酮耐药菌外排泵抑制试验

3 结果

3．1 菌株分布情况

3．2 体外药敏结果

3．3 PMQR基因

3．4 QROR突变

3．5 外排泵抑制试验

4 讨论

5 小结

参考文献

第二部分 氟喹诺酮耐药及多PMQR大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌遗传特征研究

引言

1 材料

1．1 菌株

1．2 试剂和耗材

1．3 仪器和软件

2 研究方法

2．1 多位点序列分型(MLST)

2．2 多位点序列分型结果分析

2．3 遗传谱系测定

2．4 质粒复制子分型

2．5 质粒接合试验

2．6 接合子MIC测定

3 结果

3．1 多位点序列分型

3．2 环丙沙星耐药大肠埃希菌遗传谱系分组

3．3 多PMQR基因耐药质粒遗传分型

3．4 接合实验

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 RND外排泵AcrAB-TolC

作者简历及在学期间所取得的科研成果