维生素C调控滋养层干细胞分化和妊娠维持的效应及分子机制

摘要

早在70年前已有文献报道，妊娠妇女若缺乏维生素C(vitamin C，VC)则容易出现自发性流产，而补充VC能减少自发性流产的发生。这提示VC在妊娠维持中可能扮演了重要的角色。本研究室近几年的研究表明，VC能诱导人胎盘细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞株JEG-3、JAR产生甾体激素(E2和P4)和多肽激素(βhCG)，但对VC维持妊娠的具体分子机制尚不清楚。妊娠维持需要胎盘正常发育并行使其正常功能，胎盘的形成则需要其内部的滋养层干细胞(trophoblast stemcell，TSC)。TSC经各种转录因子调控，分化形成各种特异性的滋养层细胞。VC是否通过调控TSC分化为各种特异性滋养层细胞的过程，进而影响胎盘的妊娠维持，尚未见报道。因此，深入研究VC在TSC分化过程中的具体调控机制以及对胎盘妊娠维持的效应，对揭示VC在妊娠维持中的作用具有重要的科学意义。
　　本研究通过体外和体内试验发现，VC能促进TSC分化以及妊娠维持的过程。
　　1.在TSC分化的过程中，研究发现，VC处理能诱导TSC分化时Ctsq、 PL-Ⅱ、SynA和Gcm1的mRNA表达增高。Ctsq是迷路层窦状巨细胞(sinosoidal trophoblastgiant cell，S-TGC)的特异性marker，SynA和Gcm1是迷路层合胞体滋养层细胞的marker，上述结果提示VC能促进TSC向迷路层细胞方向进行选择性分化，尤其是S-TGC方向的分化。TSC定向分化为S-TGC是由碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Hand1调控的。通过基因和蛋白质水平的检测，发现VC能增高支配S-TGC分化的转录因子Hand1的蛋白水平，对mRNA水平则没有影响;核质分离实验显示，VC同时增加TSC胞浆和胞核内Hand1的蛋白水平。
　　为再次验证VC能够调控Hand1蛋白的水平，通过VC处理外源转染Flag标记的Hand1（Flag-Hand1）人绒毛膜癌细胞JEG-3。Western blot和免疫荧光结果均表明，VC可以剂量和时间依赖性提高Hand1的蛋白水平。已有研究发现，TSC向TGC分化是通过Hand1形成同源二聚体而发挥作用的。因此，我们通过免疫共沉淀实验证实，Hand1可以形成同源二聚体，VC能增加Hand1总蛋白量，从而导致形成同源二聚体的Hand1数量增多，而对Hand1本身形成同源二聚体的能力并没有影响。上述结果揭示，VC主要通过调控转录因子Hand1的蛋白表达水平，诱导TSC向S-TGC方向分化。
　　2.VC调控Hand1蛋白水平的具体机制。Western blot检测发现，不同浓度的VC处理TSC细胞1h，可剂量依赖性降低TSC细胞中的MAPK信号通路JNK和P38的磷酸化水平。为探究MAPK信号通路是否可能参与VC诱导的S-TGC分化，我们在VC诱导TSC分化的过程中，添加JNK和P38激动剂Anisomycin，观察其对VC诱导TSC分化的影响。qPCR检测发现，Anisomycin能够剂量依赖性降低VC诱导的S-TGC的Marker——Ctsq的mRNA水平。同时，Anisomycin能减少内、外源性Hand1的蛋白水平。相反，在TSC分化的过程中，通过JNK抑制剂SP600125和P38抑制剂SB203580分别处理TSC，以分别抑制JNK和P38信号通路，是否可以模拟VC诱导的TSC分化？qPCR和Western blot检测发现，只有SP600125处理能剂量依赖性增高促进Ctsq mRNA的表达水平以及Flag-Hand1的蛋白表达水平，而SB203580没有相似的作用，提示VC只通过JNK调控Hand1蛋白的水平。为进一步证实是JNK调控了Hand1，将构建的激活形式的JNK1（JNK*）和Hand1共转染JEG-3细胞48h，Western blot检测表明，JNK1*可减少Hand1蛋白的水平，而VC处理并不改变JNK1激活所致Hand1蛋白水平的减少。与此结果相一致，通过慢病毒感染JNK1/2shRNA特异性敲降JEG3中的JNK1/2水平，能增高Hand1蛋白的水平。上述结果揭示，VC通过抑制TSC中JNK1的活性提高Hand1蛋白的水平。为进一步探究是否JNK1和Hand1有直接的作用，将JNK1*和Myc-Hand1共转染293T细胞，免疫共沉淀结果发现，JNK1*与Hand1蛋白有直接的结合。
　　3.进一步探究JNK是如何调控Hand1蛋白的。之前的结果表明，JNK激动剂Anisomycin处理能降低Hand蛋白的水平，而JNK抑制剂SP600125处理能够增高Flag-Hand1的蛋白水平，提示是否JNK通过其激酶活性来调控Hand1蛋白的稳定性。因此，我们构建了持续失活突变的JNK1*（JNK*APF），将JNK1*APF和JNK1*分别与Hand1共转染JEG-3细胞。结果显示，JNK1确实是通过其激酶活性来调控Hand1蛋白的稳定性。为探究JNK激酶具体调控Hand1的哪一个或哪几个氨基酸位点，我们通过磷酸化预测软件GPS分析了Hand1蛋白中潜在的JNK磷酸化位点，并分别构建其失活突变体。JNK1*和各个Hand1突变体共转染JEG-3细胞48h，Western blot检测发现，JNK1*不能减少p.S48A突变的Hand1，且使野生型Hand1和其他突变体蛋白位置上移的现象在p.S48A突变后消失。由此推测，第48位点的磷酸化会减弱Hand1蛋白的稳定性。为验证该假设，构建了模拟磷酸化形式的p.S48D突变的Hand1，Western blot和免疫荧光结果均表明，与野生型相比，p.S48A突变能够增加Hand1的蛋白含量，而p.S48D突变降低Hand1蛋白的含量。为证实JNK是否是通过磷酸化Hand1，进而使其发生降解而减少其蛋白的含量，我们用泛素化降解抑制剂MG132处理共转染JNK*和Hand1的JEG-3细胞。Western blot结果显示，MG132能够阻断JNK*磷酸化Hand1所导致的减少，表明JNK*磷酸化的Hand1可被泛素化体系识别并降解。与此结果相符，将Flag-Hand1和HA-Ubiqutin共转染293T细胞，免疫共沉淀检测发现，VC处理能够减少连接结合在Hand1蛋白上的泛素的量。以上结果显示，JNK通过其激酶活性调控Hand1蛋白，使Hand1的第48位丝氨酸(serine)发生磷酸化，促进其泛素化降解。
　　4.VC对妊娠维持的影响。为揭示VC对妊娠维持的影响，我们通过Talen技术构建特异性敲除C57小鼠VC合成限速酶——L-古洛糖酸内酯氧化酶(L-Gulo)，使其自身不能合成VC，以观察缺乏VC对小鼠妊娠维持的影响。母鼠交配验到栓后，开始断VC(E0.5 d)，通过液相色谱对血清VC含量进行检测，发现E8.5d的Gulo-/-母鼠体内VC水平很微弱或检测不到。取E18.5d妊娠母鼠，发现缺乏VC可促进胎鼠的吸收，正常存活的胎鼠重量明显低于VC补充组。Western blot检测剩余存活胎盘中的Hand1蛋白，发现缺乏VC组胎盘中的Hand1表达水平明显降低。在正常情况下，胎盘发育于E13.5 d已基本完成，而在缺乏VC组未见到胎盘吸收情况发生，但通过对该妊娠天数的胎盘进行H-E检测，发现缺乏VC使得胎盘迷路层结构间质结构增多，空隙增大。免疫组化检测CK（胎盘S-TGC的marker）和lamin（胎鼠血管marker），发现缺乏VC可使S-TGC位置不均匀分布，胎鼠血管呈直线型，未出现正常情况下网络状交汇分布的现象，提示缺乏VC可能影响Hand1的表达水平，以及迷路层S-TGC的形成和分布，进而使得母鼠-胎鼠血管交汇处获得的营养物质不能满足日益增大的胎鼠的需求，从而导致部分胎鼠出现体重下降、严重的即出现妊娠维持失败而表现为胎儿吸收状况。
　　综上所述，本研究从细胞生物学的角度阐明了VC主要通过抑制JNK信号通路上调Hand1转录因子的稳定性和蛋白水平，进而诱导TSC选择性分化为迷路层S-TGC过程中的具体调控。小鼠模型研究发现，缺乏VC导致胎盘迷路层结构发生紊乱，间质结构增多，空隙增大。母体血管和胎鼠血管交汇不足，导致胎鼠营养获取不足、体重减轻，甚至妊娠维持失败。这可能是VC不足或缺乏导致妊娠维持失败的主要原因。本研究有助于解释目前国际上对维生素包括VC、VE等在体内补充问题引起的极大争论;同时，将为VC新的生理学效应、VC在妊娠中的重要角色、妊娠维持、胎儿发育的生理基础等提供新的视角。

目录

声明

致谢

摘要

英语缩略词表

1 引言

1．1 胎盘初期发育的过程

1．2 成熟胎盘各层中各种滋养层细胞的类型

1．3 胎盘发育的研究

1．4 对维生素C的早期认识

1．5 Vc对干细胞的作用

1．6 Vc与妊娠相关

2 材料和方法

2．1 实验仪器

2．2 实验材料与试剂

2．3 实验方法

3 结果

3．1 TSC增殖和分化体系的建立

3．2 Vc诱导TSC往迷路层方向分化，尤其是S-TGC方向分化

3．3 Vc调控转录因子Hand1蛋白的水平来调控TSC向S-TGC分化

3．4 Vc通过抑制TSC中的JNK信号来提高Hand1的水平

3．5 JNK信号通过调控Hand1蛋白S48位点磷酸化，促使其泛素化降解

3．6 Vc补充促进妊娠胎盘中S-TGC的分布

4 讨论和结论

5 结论

参考文献

综述 维生素C与表观遗传学的改变

作者简介及在读期间所取得的科研成果和奖励