Meynert基底核中microRNA-132和EgR-1在阿尔兹海默病程中的变化特征

摘要

目的:胆碱能Meynert基底核(Nucleus Basalis of Meynert，NBM)是脑内神经递质乙酰胆碱的主要产生脑区，与学习记忆功能密切相关。NBM在阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)中严重受损。以往的针对死亡后人脑样本和在体的研究发现，在AD进程的早期（神经病理学诊断之Braak分期Ⅱ-Ⅲ期）NBM神经元激活伴随着代谢活性增强，但是，在AD晚期（例如BraakⅤ-Ⅵ期）NBM呈现退行性改变。研究者在AD患者的前额叶(prefrontal cortex，PFC)也发现存在着神经元活性于AD早期激活而于AD晚期降低现象，表现为大量的与突触活性和可塑性调节相关的基因在AD早期上调而于AD晚期下调。这些发现提示，这种脑区活性先升后降的变化类型可能是AD病程中脑活性变化的较为普遍的现象，虽然也有其他现象存在。由于AD早期的这种神经元活性激活可能具有神经元保护作用，使得该阶段脑功能获得代偿而缺乏AD的临床表现，因此揭示这种AD脑区活性早期激活而晚期降低的调控因素与工作机理，尤其是早期维护脑活性的因素，将对于全面、深刻理解AD发病机制、寻找激活AD晚期脑功能的治疗策略或药物靶点具有重要科学意义。本研究以两个具有促进突触活性和突触可塑性功能，在AD病程中于PFC中显示先升后降的基因表达改变模式，并且与AD病理学标记及胆碱能活性密切相关的分子，即miRNA-132(miR-132)和早期生长因子1(Earlygrowth response1，Egr-1)作为候选分子研究这种调节机制。我们于死亡后人脑研究样本，包含AD发展的整个进程，也即从AD的神经病理学分期Braak0到BraakⅥ期期间，研究在NBM内miR-132和Egr-1的表达变化，以及其与经典AD病理标记即过度磷酸化的tau与细胞内外的β-淀粉样蛋白(Amyloid beta，Aβ)，以及与胆碱合成酶，即胆碱乙酰转移酶（choline acetylcholinesterase，ChAT）的关联。我们还研究了它们与载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）ε4携带情况的关联，以及与神经元退行性变的参数包括细胞萎缩、细胞密度降低等的关联。旨在探究miR-132和/或Egr-1是否可能参与AD进程中的胆碱能NBM活性变化调节。
　　材料与方法:我们采用由荷兰人脑库(Netherlands Brain Bank，NBB)提供的包含NBM的福尔马林固定、石蜡包埋的下丘脑样本进行研究。这些样本包括非痴呆症的对照者（Braak分期=0）以及AD不同进程中的患者，即从Braak分期=Ⅰ到Braak分期=Ⅵ的患者，每期样本量n=7，共49个样本。7期样本之间按照性别、年龄、死亡后延搁时间(postmortem delay，PMD)、脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid，CSF)pH值、APOE基因型、死亡时间、组织固定和贮存时间等进行完好匹配以消除研究的混淆因素。我们还根据以往研究按主要临床类型将脑研究样本分为三大组，即Braak0-Ⅱ，主要为无症状(no symptom，NS)对照组;BraakⅢ-Ⅳ，主要为MCI组;Braak stageⅤ-Ⅵ，主要为AD组。我们选取位于穹窿和/或前联合位置的NBM的Ch4-am或Ch4-al区脑片进行连续切片，分别采用硫堇染色定位并研究神经元数目和神经元萎缩观察;采用免疫细胞化学染色(immunocytochemistry,ICC)包括采用AT8抗体检测过度磷酸化的tau、采用4G8抗体检测细胞内、细胞外的Aβ、采用抗ChAT抗体检测NBM中的胆碱能神经元、采用Egr-1抗体检测Egr-1的表达量。此外我们还采用Gallyas银染检测嗜银的神经元纤维样缠绕(Neurofibrillary tangles，NFT)，并采用原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)检测miR-132的表达量。采用图像分析获得的整合光密度值(integrated opticaldensity，IOD)定量ICC和ISH信号。
　　结果:NBM中miR-132和Egr-1表达直到MCI期仍保持相对稳定，而于AD后期（BraakⅤ-Ⅵ期）呈现显著下降趋势或呈现显著下降（S-N-K，P=0.055和P＜0.05）。NBM中miR-132(r=0.49，P＜0.001)和Egr-1(r=0.61，P＜0.001)的表达量与ChAT表达量之间呈现显著正相关。NBM的神经元密度在AD进程中保持相对稳定(ANOVA，P=0.101)，但是细胞大小在AD后期显著下降（K-W，与NS组比，P=0.00001;与MCI组比，P=0.007）。ChAT在AD早期保持稳定，在AD后期开始下降(S-N-K，P＜0.05)。NFT和Aβ在BraakⅡ和Ⅲ期之间显著升高，之后，NFT继续升高而Aβ直至BraakⅥ期都保持相对稳定(S-N-K，P＜0.05)。在AD早期（BraakⅡ-Ⅳ期）NBM中由抗AT8染色的过度磷酸化的tau占主导，而银染的NFT和神经毡（Neuropil threads，NT）在AD进程的后期（BraakⅤ-Ⅵ期）更为明显。ChAT的表达量与过度磷酸化的tau成显著负相关(r=-0.33，P=0.021)，而与Aβ没有相关性，提示tau的病理变化而不是Aβ与NBM的神经退行性改变关系更为密切。此外，我们发现在所有的Braak分期中NBM内的Aβ都位于细胞外。最后，在MCI组，APOEε4携带者的ChAT显著低于非ApoEε4携带者(S-N-K，P＜0.05);在NS组，APOEε4携带者的NBM内Aβ高于非ApoEε4携带者(S-N-K，P＜0.05)。
　　结论:从microRNA和Egr-1在AD进程中的变化我们得出:1）这两个分子可能在AD早期对保持NBM胆碱能功能稳定起作用;2）可能导致NBM的晚期退行性变。

目录

声明

致谢

序言

摘要

缩略词表

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5．结论与展望

参考文献

附录

综述 如何在衰老过程中保持大脑的健康?基因-环境的交互作用和大脑激活

作者简历及在学期间所取得的科研成果