Cf介导的ETI和针对稻白叶枯病菌的非寄主抗性的分子调控机理

摘要

根据所涉植物是否为所涉病原物的寄主，植物的抗病性可分为寄主抗性和非寄主抗性(nonhost resistance)。两类抗病性的产生机理既有许多共同点也有一些明显的区别。寄主抗性有病原相关分子模式触发的免疫(PAMP triggered immunity，PTI)和病原物效应蛋白触发的免疫(Effector triggered immunity, ETI)两个层次。番茄与叶霉菌(Cladosporium fulvum)的互作为典型的基因对基因(gene-for-gene)寄主抗性，番茄抗叶霉菌基因Cf介导产生对携带互补Avr基因的叶霉菌的ETI抗性。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)寄主范围窄，在非寄主本氏烟(Nicotianabenthamiana)中诱导产生强烈的过敏性反应(hypersensitive response，HR)和非寄主抗性。本论文主要针对两个问题开展研究，首先，传统观念认为，介导产生ETI的植物抗病(resistance，R)基因不存在转录和转录后水平的基因表达调控。本论文通过对Cf介导的ETI研究发现，番茄Cf基因存在转录和转录后水平的调控;另外，本氏烟中Xoo诱导的HR和非寄主抗性产生机理尚不明确。本研究采用多种策略筛选鉴定该非寄主抗性调控基因，并明确了农杆菌对该非寄主抗性的抑制作用及机制。本研究获得了以下主要结果:
　　1.初步明确了番茄抗叶霉病基因Cf-4和Cf-9基因表达调控机理。分别从转录水平—DNA甲基化以及转录后水平—miRNA两个层次，对Cf-4和Cf-9基因表达调控机理进行了分析。在转录水平上，高温抑制Cf基因的表达，Avr强烈诱导Cf基因的表达，Cf-4的表达随着番茄植株株龄增加而升高，而Cf-9不受显著影响。启动子DNA甲基化参与高温抑制的以及常温下Avr9诱导的Cf-9基因的表达调控，另外在由高温到常温的降温过程中Avr4和Avr9对Cf-4和Cf-9基因表达的诱导作用可能受到甲基化的调控。采用VIGS技术，分析了番茄甲基化酶以及去甲基化酶基因对Cf基因表达的影响，发现番茄个别甲基化酶和全部4个去甲基化酶基因单独沉默显著改变Cf-4和Cf-9基因的表达，说明这些番茄甲基化酶和去甲基化酶基因可能参与对Cf表达的调控。在转录后水平，我们预测到了一条能够同时靶标Cf-4和Cf-9基因的长度为21nt的miRNA。通过该miRNA的靶标序列与前体序列共表达等分析，证实该miRNA能有效降解Cf-4和Cf-9 mRNA。
　　2.筛选获得一批Cf-4/Avr4介导的HR的调控基因。通过差异表达蛋白对应基因的功能分析及本氏烟cDNA文库VIGS筛选，我们从500多个基因沉默结构中，筛选得到了28个参与调控Cf-4/Avr4介导的HR的基因，其中核糖核蛋白RNP、一个DNA结合蛋白和一个Dof锌指蛋白等正调控Cf-4/Avr4介导的HR，而一个环指蛋白、一个含BTB/POZ和TAZ结构域蛋白、CP结合蛋白、SUMO结合酶SCE1、红色叶绿素代谢产物还原酶RCCR等22个蛋白负调控Cf-4/Avr4介导的HR。
　　3.建立和优化了本氏烟—Xoo非寄主抗性互作体系并研究明确H2O2积累是Xoo诱导的HR和非寄主抗性产生所必需。研究结果表明，用1×108 cfu/ml的Xoo接种本氏烟完全展开的叶片，28℃下培养将产生最迅速最强烈的非寄主抗性。Xoo接种先在浸润区域内诱导活性氧大量积累，而后导致产生强烈的HR，并强烈诱导PR和HR标志基因的表达，最终导致Xoo的菌量急剧下降。采用过氧化氢酶清除H2O2的药理学实验结果表明，H2O2在Xoo诱导的HR和非寄主抗性中至关重要。
　　4.筛选获得一批Xoo诱导的本氏烟非寄主抗性调控基因。通过差异表达蛋白对应基因功能分析及本氏烟cDNA文库VIGS筛选，我们从500多个基因沉默结构中筛选获得了8个调控Xoo诱导的本氏烟HR的基因，其中碳酸酐酶、硫氧还蛋白hl以及核糖核蛋白是该HR的负调控因子，而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、尿嘧啶特异的内切酶DnaJ同源亚家族基因成员、GTP结合蛋白以及三生烟中的硫氧还蛋白h这五个基因则为正调控因子。本氏烟核糖核蛋白基因同时参与Xoo诱导的HR和Cf-4/Avr4介导的HR的调控，但作用相反。
　　5.阐明了农杆菌对Xoo的抑菌作用以及对Xoo诱导的HR的抑制作用及其机制。结果显示，四种农杆菌菌株对Xoo诱导的HR的抑制作用有显著差异，菌株GV3101，EHA105和LBA4404能强烈抑制，但菌株C58C1无此作用。三种农杆菌对Xoo诱导的HR的抑制作用机制不同，菌株GV3101通过直接抑制Xoo的生长来抑制HR，该抑制作用需要Xoo中三型分泌系统基因hrcU和农杆菌Ti质粒pTiC58的参与。菌株LBA4404和EHA105则无直接抑菌作用，而是通过抑制本氏烟上活性氧的积累来抑制HR的产生。
　　综上所述，本研究首次揭示了f-4和f-9基因表达在转录及转录后水平的调控作用及其机理，鉴定了首个调节Cf基因表达的miRNA。此外，利用cDNA文库VIGS筛选技术，从500多个基因沉默结构中筛选获得一批参与Xoo诱导的本氏烟HR和Cf-4/Avr4介导的HR的新调控基因。另外，首次揭示农杆菌对Xoo本身及其诱导的HR的抑制作用及其机理。这些研究结果增进对植物寄主ETI抗性和非寄主抗性产生机理的理解。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1 研究背景

1．1 植物免疫系统

1．1．1 PMAP诱发的植物免疫

1．1．2 效应子诱发的植物免疫

1．1．3 番茄Cf-4与Avr4及Cf-9与Avr9互作

1．2 植物非寄主抗性研究进展

1．2．1 植物非寄主抗性类型

1．2．2 植物非寄主抗性机理

1．2．3 植物非寄主抗性和植物寄主抗性的协同调控

1．2．4 植物非寄主抗性的应用

1．3 农杆菌与植物互作研究进展

1．3．1 农杆菌及其发现

1．3．2 根癌农杆菌的侵染过程

1．3．3 农杆菌与植物互作研究进展

1．3．4 农杆菌对植物-病原微生物互作的影响

1．4 DNA甲基化及其对植物抗病性的调控作用研究进展

1．4．1 DNA甲基化及去甲基化

1．4．2 DNA甲基化对基因表达调控的影响

1．4．3 DNA甲基化在植物发育中的作用

1．4．4 DNA甲基化对植物抗病性的调控作用

1．5 本论文研究的目的和意义

2 番茄抗叶霉病基因Cf-4和Cf-9的表达调控机理分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料和取样

2．1．2 基因表达的实时荧光定量PCR分析

2．1．3 番茄总DNA提取

2．1．4 DNA甲基化检测分析

2．1．5 靶标番茄Cf-4和Cf-9的miRNA预测

2．1．6 miRNA对靶标基因的降解功能分析

2．1．7 番茄甲基化酶和去甲基化酶基因家族鉴定

2．1．8 番茄甲基化酶和去甲基化酶基因家族的VIGS功能分析

2．2 结果与分析

2．2．1 株龄对Cf-4和Cf-9基因表达以及启动子962-1284 bp区域甲基化程度的影响

2．2．2 温度对Cf-4和Cf-9基因表达以及启动子序列甲基化程度的影响

2．2．3 Avr对Cf-4和Cf-9基因表达以及启动子序列甲基化程度的影响

2．2．4 番茄甲基化酶和去甲基化酶基因家族的鉴定

2．2．5 番茄甲基化酶和去甲基化酶家族基因沉默对Cf-4和Cf-9基因表达的影响

2．2．6 番茄甲基化酶和去甲基化酶基因沉默对Cf-4和Cf-9基因甲基化的影响

2．2．7 番茄甲基化酶和去甲基化酶家族基因沉默对Cf-4和Cf-9介导的活性氧积累的影响

2．2．8 靶标Cf-4和Cf-9基因的miRNA预测

2．2．9 miRCf-4／9对Cf-4和Cf-9基因表达调控的影响

2．3 讨论

3 本氏烟中Cf-4介导的HR调控基因的筛选和功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 Ca2+信号传导途径在Cf-4介导HR中作用的药理学分析

3．2．2 9个基因对Cf-4介导HR中作用的VIGS分析

3．2．3 Cf-4介导HR的调控基因的cDNA文库VIGS筛选

3．3 讨论

4 Xoo介导的非寄主抗性调控基因的筛选和功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 细菌的培养及接种

4．1．3 本氏烟叶片活性氧染色分析

4．1．4 外源H2O2处理与本氏烟叶片中H2O2的清除

4．1．5 PR和HR标志基因表达检测

4．1．6 本氏烟基因沉默分析

4．1．7 Xoo菌量计数

4．1．8 本氏烟基因沉默cDNA均一化文库的构建

4．2 结果与分析

4．2．1 Xoo诱导本氏烟产生强烈的HR

4．2．2 本氏烟中Xoo诱导HR的影响因素

4．2．3 Xoo诱导的本氏烟非寄主抗性的生理和分子特征

4．3 H2O2在Xoo诱导的本氏烟非寄主抗性中的作用

4．3．1 外源施加H2O2促使Xoo诱导的HR更早产生

4．3．2 H2O2的清除抑制本氏烟中Xoo诱导的HR的产生

4．3．3 Xoo T3SS突变体菌株不能诱导H2O2的积累和HR的产生

4．4 从抗病差异表达基因中筛选Xoo诱导的HR调控基因

4．4．1 5个基因的沉默对Xoo诱导的HR的影响

4．4．2 5个基因的沉默对Xoo诱导的非寄主抗性的影响

4．4．3 5个基因的沉默对Xoo诱导的活性氧积累的影响

4．5 Xoo诱导的HR调控基因的本氏烟叶片cDNA文库VIGS初筛

4．5．1 本氏烟cDNA文库序列基因沉默

4．5．2 Xoo诱导的HR调控基因的筛选

4．6 硫氧还蛋白h型基因的抗病调控功能分析

4．6．1 TRX蛋白序列分析

4．6．2 NtTRXh在Xoo诱导的HR中的作用

4．6．3 NtTRXh在Xoo诱导的非寄主抗性中的作用

4．7 讨论

5 根癌农杆菌对本氏烟—Xoo非寄主抗性互作的影响及作用机制

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 Xoo PXO99A抗性菌株构建

5．1．3 农杆菌及Xoo PXO99A接种

5．1．4 菌落计数

5．1．5 本氏烟叶片中活性氧染色

5．1．6 本氏烟RNA的提取及基因表达检测

5．1．7 农杆菌对过氧化氢的耐受力分析

5．2 结果与分析

5．2．1 农杆菌菌株GV3101抑制本氏烟中Xoo PXO99A诱导的HR

5．2．2 农杆菌GV3101抑制Xoo诱导HR的时空特异性

5．2．3 其他三种农杆菌对本氏烟中Xoo诱导HR的影响

5．2．4 农杆菌GV3101强烈抑制Xoo生长

5．2．5 农杆菌菌株LBA4404和EHA105对Xoo生长有一定抑制作用，但抑制作用弱于GV3101首株

5．2．6 农杆菌GV3101的Ti质粒是重要的抑菌因子

5．2．7 农杆菌菌株LBA4404和EHA105通过抑制本氏烟中H2O2的积累抑制Xoo诱导的HR

5．2．8 四种农杆菌菌株对H2O2的降解能力没有显著差别

5．2．9 农杆菌菌株LBA4404、EHA105和C58C1对Xoo T3SS基因表达的影响

5．3 讨论

6 全文小结与研究展望

6．1 全文小结

6．2 研究展望

附文 植物病原细菌中吩嗪-1-羧酸合成基因生物信息学分析及鉴定

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 phz基因的获得以及植物病原细菌的筛选

1．1．3 植物病原细菌phz基因的鉴定及保守结构域分析

1．1．4 Phz蛋白序列进化树构建

1．1．5 PCA的提取与鉴定

1．1．6 PCA抑菌活性检测

1．1．7 Pst DC3000基因phzF突变体构楚

1．1．8 Pst DC3000致病性检测及菌量计数

1．2 结果与分析

1．2．1 植物病原细菌中phz基因的鉴定

1．2．2 植物病原细菌中Phz的种类和数量

1．2．3 植物病原细菌phz基因在基因组上的排列

1．2．4 各个Phz蛋白系统进化树构建

1．2．5 Pst DC3000和Xoo PXO99A中PCA合成的鉴定

1．2．6 Pst DC3000和Xoo PXO99A对PCA耐受性检测

1．2．7 PCA是Pst DC3000的重要致病因子

1．3 讨论

参考文献

附录

作者攻读博士学位期间发表的学术论文