两步酶法不对称合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基已酸叔丁酯的研究

摘要

(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯((3R，5S)-CDHH）是合成具有高效降血脂药效的他汀类药物的关键手性砌块。以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯(CDOH)为出发底物，经两步生物法不对称还原的合成路径是目前最具潜力的制备方法。本论文对这两步不对称还原反应的催化剂及工艺分别进行了系统的研究，主要内容如下:
　　一、对酶法不对称还原CDOH合成(S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯((S)-CHOH)的催化剂进行筛选，确定来自Lactobacillus kefir DSM20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH(A94T/F147L/A202L/L199H))为最佳催化剂，其比活为1.27 U/mg，e.e.值＞99.5％。结合LkTADH的酶学性质研究及底物的稳定性研究，确定最佳反应条件为pH5.5，20℃。由于存在严重的底物抑制，且底物在水溶液中不稳定，故采用底物连续流加的策略，以LkTADH全细胞为催化剂进行过程工艺优化，最终将底物终浓度提高到100 g/L，反应38h，产物浓度达到401.5 mM，过程TTN数为16，060 mol/mol，副产物呋喃酮的累积量仅为6.1 mol％，时空产率达10.6 mM/h。
　　二、通过LkTADH的回复突变研究，并结合同源建模和分子对接分析，研究了LkTADH的构效关系。反应动力学研究表明LkTADH及其突变体均存在部分非竞争性底物抑制现象。F147L显著提高酶对底物CDOH的亲和力和催化效率，并部分缓解底物抑制，该点突变通过影响Asn157的构象进而使其侧链氨基与构成活性中心疏水小口袋的Glu145的羧基氧形成氢键，使Glu145在疏水口袋处侧链二面角向上偏转，稳定底物活性中心的同时，扩大的疏水口袋促进了酶对双基团酮类底物的催化。A202L使容纳叔丁基的口袋疏水性增加，提高了酶对CDOH的亲和力，并显著缓解了底物抑制。A94T和L199H缩小了底物结合口袋，反而不利于酶对CDOH的催化。
　　回复突变改造过程中得到的最佳突变体为M147-202(F147L/A202L)，其对CDOH的比活为2.61 U/mg，e.e值.＞99.5％。以M147-202全细胞为催化剂，底物终浓度为100 g/L（补料），反应21h底物完全转化，产物(S)-CHOH浓度达418.3mM，副产物的累积量仅为1.0 mol％，TTN数为16，732 mol/mol，时空产率达19.9mM/h，较同等条件下LkTADH的时空产率提高了近1倍，为该步反应目前报道的最高工艺水平。
　　三.对酶法不对称还原(S)-CHOH合成(3R，5S)-CDHH的催化剂进行筛选，确定来自Candida magnoliae CGMCC2.1919的CR为最佳催化剂，其比活达6.98U/mg，d.e.值为99.0％，通过定点突变获得热稳定性提高的葡萄糖脱氢酶GDH-Q，并将GDH-Q与CR进行共表达研究，获得能使两个酶反应速率匹配的共表达体系E.coli BL21(DE3)/pET30-CR+pACYCDuet-GDH-Q，实现辅酶的高效原位再生。以该共表达菌株全细胞为催化剂，对该不对称还原催化工艺进行研究，得到最佳反应条件为30℃、pH6.5、葡萄糖与底物质量比为1∶1，在5 gDCW/L细胞量、0.1 mM NADP+浓度下，最高底物浓度可达400 g/L，反应24 h转化率为99.5％，此时TTN数达到16,796 mol/mol，经萃取分离所得产物纯度为99％， d.e.值为99.6％。

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致谢

摘要

中英文缩写对照表

第一章 文献综述

1．1 生物催化制备(3R，5s)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯

1．1．1 (3R，5s)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的重要用途

1．1．2 (3R，5s)-CDHH的制备方法

1．1．3 采用路径2不对称合成(39，5s)-CDHH的研究进展

1．2 脱氢酶催化羰基不对称还原的机制

1．3 不对称还原过程中的辅酶原位再生

1．3．1 底物偶联法(Substrate-coupled method)

1．3．2 酶偶联法(Enzyme-coupled method)

1．4 面向工业应用的羰基还原酶酶分子改造

1．5 本论文的研究思路及研究内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 主要实验仪器及设备

2．1．3 主要药品与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 培养基

2．2．2 试剂配制

2．2．3 菌种的保藏及活化

2．2．4 基因相关操作方法

2．2．5 工程菌的诱导表达

2．2．6 重组菌体收集与细胞破碎

2．2．7 蛋白质SDS-PAGE电泳

2．2．8 蛋白的纯化

2．2．9 底物及手性产物衍生物的合成

2．2．10 化合物的表征

2．3 分析方法

2．3．1 CDOH不对称还原合成(S)-CHOH过程的定量分析方法的建立

2．3．2 (S)-CHOH的手性分析方法的建立

2．3．3 催化(S)-CHOH不对称还原合成(3R，5S)-CDHH过程的定量及手性分析方法的建立

2．3．4 酶活测定方法

2．3．5 蛋白质浓度的测定

2．3．6 生物量的测定

2．4 生物催化反应过程研究方法

2．4．1 生物催化不对称还原CDOH合成(S)-CHOH

2．4．2 模拟方法

2．4．3 生物催化不对称还原(S)-CHOh合成(3R，55)-CDHH

第三章 酶法不对称还原催化剂的筛选

3．1 引言

3．2 催化CDOH不对称还原的氧化还原酶的筛选

3．2．1 LbADH基因的克隆

3．2．2 醇脱氢酶LkADH，LbADH，LkTADH的表达纯化与酶活分析

3．2．3 单批次全细胞催化CDOH不对称还原的过程比较

3．3 催化(S)-CHOH不对称还原的氧化还原酶的筛选

3．3．1 羰基还原酶CR，YDL及葡萄糖脱氢酶GDHBm-1的克隆

3．3．2 羰基还原酶CR，YDL，Dkr的表达纯化与酶活分析

3．3．3 双菌双酶法催化(S)-CHOH不对称还原过程的比较

3．4 本章小结

第四章 LkTADH全细胞不对称合成(S)-CHOH

4．1 引言

4．2 LKTADH的酶学性质研究及底物CDOH的稳定性研究

4．2．1 LkTADH的最适pH和pH稳定性及pH对底物稳定性的影响

4．2．2 LkTADH的最适温度和温度稳定性及温度对底物稳定性的影响

4．2．3 镁离子和EDTA对LkTADH的影响

4．2．4 LkTADH的反应动力学研究及底物的副反应动力学研究

4．3 影响LkTADH全细胞催化CDOH不对称还原的因素考察

4．3．1 底物和产物浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响

4．3．2 异丙醇和丙酮浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响

4．3．3 辅酶浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响

4．4 分批补料提高底物浓度的研究

4．5 物质的结构表征

4．6 本章小结

第五章 LkTADH的构效关系研究及分子改造

5．1 引言

5．2 同源建模

5．3 LkADH和LkTADH的结构特征分析

5．4 分子对接与催化机理研究

5．5 LkTADH的回复突变研究

5．5．1 回复突变体的构建

5．5．2 回复突变体的酶活分析

5．5．3 反应动力学研究

5．6 LlADH与M147的底物谱研究

5．7 关于LkTADH突变位点的作用机理解析

5．8 采用突变体M147-202全细胞催化CDOH不对称还原的工艺放大

5．9 本章小结

第六章 CR-GDH共表达菌株不对称合成(3R，5S)-CDHH

6．1 引言

6．2 CR的酶学性质研究

6．2．1 CR的最适pH及pH稳定性

6．2．2 CR的最适温度及温度稳定性

6．2．3 CR的动力学参数测定

6．3 葡萄糖脱氢酶的热稳定性改造

6．3．1 野生酶GDHBm-1及GDHBm-2的热稳定性

6．3．2 定点突变提商GDHBm-2的热稳定性

6．4 CR与GDH-Q高效辅酶再生系统的构建

6．4．1 CR与GDH-Q单菌共表达体系的构建

6．4．2 单菌共表达体系与其他双酶耦合方式的比较

6．5 底物(S)-CHOH和产物(3R，5S)-CDHH的稳定性研究

6．6 CR-GDH-Q共表达菌株不对称合成(3R，5S)-CDHH的研究

6．6．1 (S)-CHOH和(3R，5S)-CDHH对CR酶活的影响

6．6．2 (S)-CHOH和(3R，5S)-CDHH对CR和GDH-Q稳定性的影响

6．6．3 反应体系中葡萄糖浓度对反应的影响

6．6．4 反应体系中pH对反应的影响

6．6．5 反应体系的温度对反应的影响

6．6．6 利用自动控制pH反应装置不对称合成(3R，5S)-CDHH

6．6．7 产物(3R，5S)-CDHH的后处理及表征

6．7 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

附录

作者简介