蝶蛹金小峰寄生对寄主转录组的影响及三种毒蛋白分子特性分析

摘要

菜粉蝶为十字花科蔬菜重要的害虫，其危害严重，蝶蛹金小蜂为菜粉蝶的蛹期优势寄生蜂(Hu，1983)。寄生蜂雌蜂将一种或多种寄生因子注入寄主体内，用来抑制寄主免疫、调控寄主生长发育和营养代谢等生理活动。这些寄生因子包括，毒液、多分DNA病毒(PDVs)、类病毒颗粒，卵巢蛋白等(Pennacchio et al.，2006)。在不含有PDVs的寄生蜂中，毒液为抑制寄主免疫的关键因子(Asgari et al.，2011)。寄生蜂除了能够抑制寄主免疫外，还能够通过影响寄主的神经肽基因来间接影响寄主的发育(Shi et al.，2015)。前期研究表明，菜粉蝶蛹在注射蝶蛹金小蜂毒液30分钟后其免疫反应就能被抑制(Fang et al.，2010)。因此，本研究通过比较寄生1小时和未寄生的菜粉蝶蛹转录组，来探究寄生对寄主整体基因表达的影响。同时，对蝶蛹金小蜂的三个毒液蛋白的生理功能展开了研究。
　　1.通过比较分析寄生和非寄生的菜粉蝶蛹转录组，研究在寄生后的早期阶段，寄主体内整体基因的转录水平的变化，特别是免疫相关基因的变化。通过拼接菜粉蝶蛹转录组，得到了45，639个转录本和27，659个非冗余Unigenes。Unigene的平均长度为790bp。27，659个Unigenes中，共有18，377个Unigene被成功注释。同时，还鉴定出557个差异表达基因，其中有21个为免疫相关基因。寄生导致大部分模式识别受体基因表达被下调，而丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达量被上调。本研究为蝶蛹金小蜂与其寄主菜粉蝶在分子水平上的互作研究奠定了理论基础。
　　2.γ-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在，γ-谷氨酰转肽酶通常参与谷胱甘肽的代谢，在抗氧化、解毒和炎症过程中起关键作用。通过分析蝶蛹金小蜂毒腺转录组和蛋白质组，发现了一个可能编码γ-谷氨酰转肽酶蛋白(PpGGT)的基因序列。通过比较毒腺和残体（不含毒腺）的转录组，发现PpGGT在毒腺中高表达。通过RACE技术，克隆得到了PpGGT的基因序列。序列分析表明，编码PpGGT的cDNA序列全长2274bp，ORF长1959bp，共编码652个氨基酸残基。采用Editseq软件包对PpGGT基因序列进行预测，其理论分子量大小为72.196kDa，等电点为8.25。多序列比对显示，PpGGT的成熟肽由大小两个亚基组成。定量PCR、Western blot和免疫组化结果表明，PpGGT在蝶蛹金小蜂毒器官中高表达，在其它组织中，几乎检测不到。PpGGT在羽化后1到6天的毒器官中都有表达，第六天表达量最高。在毒液和重组表达的PpGGT中，都能够检测到GGT的活力。推测PpGGT能够通过影响寄主体内的谷胱甘肽代谢平衡，从而诱导血细胞的凋亡。
　　3.几丁质结合蛋白存在于多种生物中，并参与多种重要的生理活动。我们通过分析蝶蛹金小蜂毒腺转录组发现了蝶蛹金小蜂几丁质结合蛋白(PpCBP)基因的部分序列。通过RACE技术，克隆得到PpCBP的全长cDNA序列。PpCBP基因能够编码96个氨基酸，包括一个分泌信号肽和一个Peritrophin-A domain。进化树分析显示PpCBP的几丁质结合功能域与丽蝇蛹集金小蜂的几丁质结合功能域以及墨吉对虾卵巢膜聚为一类。定量PCR、Western blot和免疫组织定位结果显示，PpCBP在蝶蛹金小蜂毒器官中高表达。时间动态分析表明，PpCBP在蝶蛹金小蜂羽化后第4天的毒器官中表达量最高。结合测定结果表明，重组PpCBP能够与几丁质相结合，而不能与纤维素相结合。蝶蛹金小蜂毒囊中含有几丁质，因此推测PpCBP为毒囊的组成成分，并保护毒囊免受毒腺中活性组分的伤害。
　　4.丝氨酸蛋白酶同源物参与昆虫的多种生理活动。通过分析蝶蛹金小蜂毒腺转录组，我们发现了蝶蛹金小蜂丝氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)的部分序列。通过比较毒腺和残体（不含毒腺）的转录组，发现PpSPH29在毒腺中高表达。通过RACE技术，从蝶蛹金小蜂毒腺中克隆获得了PpSPH29的cDNA全长序列。PpSPH29基因全长1065bp，共编码270个氨基酸。通过Editseq预测显示，PpSPH29的等电点为4.4，分子量大小为29.4kDa。通过多序列比对发现，PpSPH29在碳端含有一个催化活性域。其中，催化活性域中的第三个氨基酸残基被替换为甘氨酸。定量PCR和Western blot的结果同样证明，PpSPH29仅在毒器官中被检测到，在其它组织中没有检测到。这些结果为深入研究寄生蜂毒液中丝氨酸蛋白酶同源物的功能奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

前言

第一章 文献综述

1．1 寄生蜂毒液蛋白

1．1．1 寄生蜂毒液的理化性质

1．1．2 酶和酶抑制剂

1．1．3 抗茵活性物质

1．1．4 麻痹毒素

1．1．5 其它蛋白

1．2 寄生蜂毒液的功能

1．2．1 对寄主细胞免疫的影响

1．2．2 对寄主体液免疫的影响

1．2．3 调控寄主的生长发育

1．2．4 破坏寄主的神经系统

第二章 蝶蛹金小蜂寄生对寄主菜粉蝶转录组的影响

2．1 斌料与方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 试剂与仪器

2．1．3 RNA抽取

2．1．4 转录组文库构建和测序

2．1．5 序列拼接和基因注释

2．1．6 差异表达基因

2．1．7 差异表达基因GO富集分析和KEGG富集分析

2．1．8 qRT-PCR验证

2．1．9 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 高通量测序和De novo拼接

2．2．2 非冗余Unigene的注释与分类

2．2．3 差异基因分析

2．2．4 寄生对寄主免疫相关基因表达的影响

2．2．5 定量验证

2．3 讨论

第三章 蝶蛹金小蜂毒液γ-谷氨酰转肽酶(PpGGT)基因克隆与分子特性分析

3．1 拣料与方法

3．1．1 供试昆虫

3．1．2 试剂与仪器

3．1．3 γ-谷氨酰转肽酶酶活测定

3．1．4 3’RACE和5’RACE

3．1．5 序列拼接与分析

3．1．6 原核表达与抗体制备

3．1．7 组织表达分布

3．1．8 时期表达分布

3．1．9 真核表达

3．1．10 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 编码蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT基因克隆与序列分析

3．2．2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的原核表达与抗体制备

3．2．3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的组织分布

3．2．4 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的时期分布

3．2．5 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的真核表达与纯化

3．2．6 γ-谷氨酰转肽酶酶活测定

3．3 讨论

第四章 蝶蛹金小蜂毒液几丁质结合蛋白(PpCBP)基因克隆与分子特性分析

4．1 精料与方法

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 试剂与仪器

4．1．3 3’RACE和5’RACE

4．1．4 序列拼接与分析

4．1．5 原核表达与抗体制备

4．1．6 组织表达分布

4．1．7 时期表达分布

4．1．8 几丁质结合测定

4．1．9 纤维素结合测定

4．1．10 免疫组织化学

4．1．11 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 编码蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP基因克隆与序列分析

4．2．2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的原核表达与抗体制备

4．2．3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的组织分布

4．2．4 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的时期分布

4．2．5 组织定位

4．2．6 几丁质和纤维素结合测定

4．3 讨论

第五章 蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)基因克隆与分子特性分析

5．1 材料与方法

5．1．1 供试昆虫

5．1．2 试剂与仪器

5．1．3 3’RACE和5’RACE

5．1．4 序列拼接与分析

5．1．5 原核表达与抗体制备

5．1．6 组织表达分布

5．1．7 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 编码蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29基因克隆与序列分析

5．2．2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29的原核表达与抗体制备

5．2．3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29的组织分布

5．3．讨论

总结

参考文献

作者简历