乌龙茶多糖理化性质及抗氧化、降血糖活性研究

摘要

近二十年来，茶多糖因其多种生理功效而备受关注，特别是抗氧化活性和降血糖作用。本论文以国内市场上三种发酵程度不同的乌龙茶（安溪铁观音、凤凰单枞、武夷大红袍）为原料，提取乌龙茶粗多糖，比较分析其理化性质和体外抗氧化、降血糖生理活性。之后，根据其生理活性，筛选出活性高的大红袍茶多糖进行体内抗氧化，降血糖研究，并探讨降血糖机理。同时，分离纯化大红袍茶多糖，研究分离产物的分子结构和化学成分，体内体外生理活性，初步探讨构效关系。实验结论如下:
　　1.以安溪铁观音、凤凰单枞、武夷大红袍为原料提取乌龙茶多糖，分别命名为TTPS、FTPS和DTPS其中DTPS得率最高，为1.84％，是得率最低的TTPS(0.83％)2倍以上。结合化学成分分析和红外图谱，表明这三种茶多糖是一类水溶性的酸性糖蛋白，主要有糖醛酸、中性糖和蛋白质三类物质构成，三者含量达70％以上，其中糖醛酸含量最高，中性糖其次，蛋白质最低。三者的蛋白质含量呈现极显著差异(p＜0.05)，并随发酵程度的加深而增加，其中DTPS的含量最高(9.30％)，TTPS则最低(5.57％)。气相色谱GC分析三种乌龙茶多糖的单糖组分及摩尔比，发现它们都含有L-鼠李糖，D-岩藻糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖这7种单糖，但摩尔比不同。凝胶色谱层析法检测这三种乌龙茶多糖的分子量，发现其分子量较大，达到104～106数量级。
　　通过对这三种乌龙茶多糖的体外生理活性研究表明，DTPS的抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶抑制作用最好，FTPS其次，TTPS最弱，且与蛋白质含量呈显著正相关(r＞0.95)。而这可能与乌龙茶的发酵程度有关，发酵程度越大，其生理活性就越好。因为发酵程度会显著影响茶多糖的化学组成（如蛋白质含量），分子量，分子间相互作用及构象，从而影响茶多糖的生理活性。
　　2.根据上一章试验结果，筛选出活性高的大红袍茶多糖DTPS进一步体内活性研究。DTPS对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠餐后血糖、空腹血糖、“三多一少”糖尿病症状、胰腺组织的影响研究表明，DTPS能缓解糖尿病小鼠餐后血糖升高速度和幅度，缩短高血糖作用时间;缓解改善糖尿病“三多一少”症状;减轻四氧嘧啶诱导小鼠胰岛损伤的作用，增加胰岛数目，增大胰岛面积;降低空腹血糖，且最佳作用时效为第2周。体内抗氧化活性研究表明，DTPS灌胃4周后，DTPS-40组小鼠血清和肝脏组织中的MDA含量都显著下降， SOD和GSH-Px抗氧化酶活性显著上升。
　　综合评价DTPS体内体外抗氧化、降血糖作用表明，大红袍茶多糖是一种有效的抗氧化剂，能通过直接清除自由基或提高体内抗氧化酶活性，抑制机体脂质过氧化反应，缓解自由基对细胞的损伤作用;DTPS对糖尿病有一定防治作用，其作用机制可能是:(1)通过抑制α-葡糖糖甘酶活性，抑制葡萄糖在小肠的吸收，降低餐后血糖;(2)缓解糖尿病机体胰岛数目减少，胰岛面积减小的症状，改善胰岛功能，提高机体胰岛素的供给;(3)通过抗氧化作用，减轻自由基对β细胞的损伤。
　　3.大红袍茶多糖DTPS经DEAE-52纤维素柱层析洗脱分离后得到4组分，分别为DTPS-0，DTPS-1，DTPS-2和DTPS-3，其中0.2 mol/L NaCI洗脱的DTPS-2组分得率最高，为31.9％。洗脱分离后，4组分的蛋白质含量急剧下降至0.21％-0.83％，以糖醛酸和中性糖含量为主。HPLC检测4组分的单糖成分表明，4组分都含有L-鼠李糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，木糖和半乳糖醛酸这7种单糖，但摩尔比不同。
　　红外图谱，扫描电镜和原子力显微镜分析4组分的结构表明，4组分子结构中都具有多糖类物质和蛋白质的特征吸收峰，DTPS-0为含有呋喃环的糖蛋白复合物，DTPS-1、DTPS-2和DTPS-3则是含有吡喃糖的糖蛋白复合物;这些糖蛋白是由多个糖链相互缔合成直径为50-100nm的多糖分子，多个多糖分子相互缠绕成直径500 nm左右的多糖颗粒，多糖颗粒相互聚合呈多层次片状、无规线团状、串珠状等多种立体结构的复合物，且茶多糖中糖醛酸和蛋白含量越高，其空间结构就越复杂。
　　体外分析4组分的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶抑制作用发现，随着蛋白质含量的下降，4组分的抗氧化活性较弱，而DTPS-2和DTPS-3虽然对α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用，但显著低于未经洗脱分离的DTPS。DTPS-2对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化、降血糖作用研究结果也表明，DTPS-2并未表现出明显的抗氧化活性和降血糖作用，这可能与其分子结构中蛋白质含量较少有关，从而侧面说明多糖中的蛋白质对其功能的体现至关重要。

目录

声明

致谢

摘要

主要缩略词

第一章 绪论

1．1 多糖的研究现状

1．2 茶多糖的研究进展

1．2．1 茶叶中的多糖含量

1．2．2 茶多糖的理化性质

1．2．3 茶多糖的生理活性

1．3 多糖分子结构分析技术

1．3．1 傅里叶红外光谱技术

1．3．2 扫描电镜(SEM)

1．3．3 原子力显微镜(AFM)

1．3．4 核磁共振技术

1．3．5 质谱技术

1．4 本论文研究内容及技术路线

1．4．1 研究内容

1．4．2 研究目的

1．4．3 技术路线

第二章 三种典型乌龙茶多糖理化性质及体外活性研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 仪器与设备

2．2．3 茶多糖的提取

2．2．4 蛋白含量测定(Bradford，1976)

2．2．5 中性糖含量测定(Morris，1948)

2．2．6 糖醛酸含量测定(BitterandMuir，1962)

2．2．7 气相色谱(GC)测定多糖的单糖组成

2．2．8 凝胶色谱层析测定分子量

2．2．9 红外光谱(IR)分析

2．2．10 DPPH自由基清除能力测定(Mohsen and Ammar， 2009)

2．2．11 ABTS自由基清除能力测定(Cai，et al.，2004)

2．2．12 铁离子还原能力测定(FRAP法)(Benzie and Strain，1999)

2．2．13 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用(Apostolidis and Lee，2010)

2．2．14 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 化学成分分析

2．3．2 单糖组分分析

2．3．3 分子量测定

2．3．4 傅立叶红外光谱分析

2．3．5 DPPH自由基清除能力

2．3．6 ABTS自由基清除能力

2．3．7 铁离子还原能力(FRAP)

2．3．8 乌龙茶多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

2．3．9 乌龙茶多糖的化学成分与活性的相关性

2．4 讨论与小结

2．4．1 乌龙茶多糖的化学成分

2．4．2 乌龙茶多糖的分子量

2．4．3 乌龙茶发酵程度对其活性的影响

2．4．4 乌龙茶多糖的体外抗氧化活性

2．5 小结

第三章 大红袍茶多糖分离纯化、理化性质及体外活性研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．2．3 DTPS的DEAE-纤维素分离纯化

3．2．4 化学成分测定

3．2．5 HPLC法检测单糖(Lv，et al.，2009)

3．2．6 红外光谱分析

3．2．7 扫描电子显徼镜(SEM)分析

3．2．8 原子力显微镜(AFM)分析

3．2．9 体外抗氧化活性评价

3．2．10 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3．2．11 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 DTPS的DEAE-52纤维素分离纯化

3．3．2 DTPS分离组分的化学成分分析

3．3．3 DTPS分离组分的单糖组分分析

3．3．4 傅立叶红外光谱分析

3．3．5 DTPS分离组分的SEM分析

3．3．6 原子力显微镜观察DTPS分离组分分子形貌

3．3．7 DTPS分离组分的抗氧化活性

3．3．8 DTPS分离组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3．4 讨论

3．4．1 阴离子交换剂DEAE纤维素的分离效果

3．4．2 茶多糖结构分析

3．4．3 荼多糖中蛋白含量对多糖功效的影响

3．5 小结

第四章 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠降血糖活性研究

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 仪器与设备

4．2．3 建立糖尿病小鼠模型

4．2．4 餐后血糖测定

4．2．5 空腹血糖测定

4．2．6 小鼠胰腺组织形态学观察(李婷婷，等，2012)

4．2．7 数据处理

4．3 结果与分析

4．3．1 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的确定

4．3．2 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠餐后血糖的影响

4．3．3 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠饮用水的影响

4．3．4 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠体重的影响

4．3．5 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

4．3．6 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠胰腺组织的影响

4．3．7 小鼠胰腺组织病理学观察

4．4 讨论

4．4．1 四氧嘧啶诱导糖尿病模型探讨

4．4．2 大红袍荼多糖防治糖尿病功效探讨

4．5 小结

第五章 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠体内抗氧化活性研究

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 材料与试剂

5．2．2 仪器与设备

5．2．3 实验对象

5．2．4 小鼠血清中MDA含量测定

5．2．5 小鼠肝脏组织MDA含量测定

5．2．6 小鼠血清中SOD活力测定

5．2．7 小鼠肝脏组织SOD活力测定

5．2．8 小鼠血清中GSH-Px活力测定

5．2．9 小鼠肝脏组织中GSH-Px活性

5．2．10 数据处理

5．3 结果与分析

5．3．1 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠血清中MDA含量的影响

5．3．2 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠肝脏组织MDA含量的影响

5．3．3 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠血清中SOD活性的影响

5．3．4 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠肝脏组织SOD活性的影响

5．3．5 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠血清中GSH-Px活性的影响

5．3．6 大红袍茶多糖对糖尿病小鼠肝脏组织GSH-Px活性的影响

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

作者简历