金华猪和大约克猪泌乳期乳腺组织的microRNA和转录组测序分析

摘要

母乳的产量和质量影响哺乳仔猪的生长速度、健康和成活率，也影响仔猪断奶体重或适宜断奶日龄，从而影响其后期的生长肥育性能。而泌乳性能主要取决于泌乳期乳腺组织的生长发育，例如乳腺上皮细胞的数量和活力等。为了获得较好的哺乳仔猪生长性能，弄清母猪乳房的生物特性是非常重要的。乳腺的发育历经胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、以及退化期等一系列时期，同时也是雌性哺乳动物出生之后唯一能够多次生长发育的器官。乳腺的重量、DNA含量和泌乳量的高峰期大约出现在母猪泌乳期的21天。研究表明许多因子和激素参与了乳腺的发育和泌乳的过程。MicroRNA（miRNA）在动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等生命活动中具有广泛的调节作用。有研究表明，miRNA参与调节乳腺的发育及泌乳相关基因的表达。尽管关于哺乳动物乳腺发育和泌乳机制的研究开展较早，但相对于人类、小鼠、牛、羊等生物而言，猪的乳腺研究比较缺乏。
　　本研究选择泌乳期21天金华猪和大约克猪各3头作为实验材料，采取乳腺组织，提取总RNA。首先利用Illumina/Solexa高通量测序技术对金华猪和大约克猪乳腺组织进行miRNA和转录组测序，以获得两猪种乳腺组织miRNA和基因表达信息，筛选差异表达的miRNA和基因，采用生物信息学方法进一步对差异表达的miRNA和基因进行靶基因预测、基因功能注释和KEGG通路分析。同时，采用实时荧光定量法(RT-PCR)比较了金华猪和大约克猪乳腺组织上与乳腺发育及泌乳相关基因的表达水平。
　　具体结果如下:
　　(1)金华猪和大约克猪乳腺组织小RNA测序分析
　　通过测序，金华猪和大约克猪乳腺小RNA文库中分别得到17，044，789和16，545，454条可比对的读数。去除掉其他类型的已知小片段RNA(rRNA，tRNA，snoRNA和snRNA)、重复片段以及mRNA的降解片段后分别获得9，672，024和6，946，954纯净序列即可用于后续miRNA的序列分析。miRNA长度分布统计发现乳腺组织miRNA序列长度主要分布在20～24 nt范围内，符合动物miRNA的长度分布特点。物种间进化分析发现猪乳腺组织miRNA在物种间有高度保守性，与人类的同源性最高，其次是牛和小鼠。基因组定位分析发现本实验中检测到的miRNA在猪基因组染色体上的位置分布差异很大，比对上18号、2号、6号染色体的miRNA数量最多，7号、8号染色体上的miRNA较少。对文库中的已知的miRNA进行显著性差异分析，共有417个差异表达的miRNA(P＜0.05)，对应着228个pre-miRNA。对差异表达的miRNA进行靶基因功能注释和KEGG通路分析，这些基因主要富集到TGF-β、MAPK、PPAR等信号通路以及谷胱甘肽代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等生物学过程中。这些通路对于乳腺发育以及乳汁成分合成都有重要的作用。
　　(2)金华猪和大约克猪乳腺组织mRNA转录组测序分析
　　利用RNA-seq技术对构建的两个品种乳腺转录组文库进行测序，结果显示金华样品共测得约2.27Gb的数据，大约克样品中共测得约2.34Gb的数据量。将新预测的两个样本的基因、转录本和外显子的统计信息与Ensembl既有的猪的参考基因组信息进行比较，分别检测到21467和29572个转录本。其中最多的是在2号染色体上，其次是1号染色体，最少的是线粒体染色体。在本研究中，共获得3032个差异表达基因（P＜0.05），差异表达水平比值的范围为-20.0722到17.3565，其中上调表达的有1755个基因，下调有1247个基因。差异基因的GO和KEGG分析揭示它们涉及的通路包括氨基酸代谢通路、脂肪酸生物合成、胰岛素信号通路、TGF-β信号通路、氧化磷酸化、甘油磷脂代谢、蛋白转运等。(3) RT-PCR结果显示，大约克乳腺组织中GHR、IGF-1R、INSR、PRLR等激素受体基因表达水平都显著高于金华猪乳腺组织（P＜0.05）。乳蛋白基因CSN2在金华猪乳腺中表达水平显著高于大约克猪（P＜0.01），但是LALBA基因在两者之间差异不显著(P＞0.05)。与金华猪相比，miR-138在大约克的乳腺中高表达，且差异极显著(P＜0.01); miR-26a、miR-186、miR-126、 miR-92a和miR-let-7g在大约克中低表达，差异极显著（P＜0.01）。
　　(4)成功分离培养了金华猪乳腺上皮细胞，细胞具有典型的上皮细胞形态学特征。转染miR-148a mimics和inhibitor之后，RT-PCR实验表明了mimics能增加细胞中miR-148a的表达(P＜0.01)，inhibitor能降低miR-148a的表达(P＜0.01)。

目录

声明

论文说明

缩略词表

摘要

1 文献综述

1．1 乳腺的生长发育

1．1．1 乳腺的结构

1．1．2 乳腺发育的过程

1．1．3 激素调控乳腺的发育

1．2 泌乳生物学

1．2．1 乳的生物学意义

1．2．2 乳腺的泌乳过程

1．2．3 乳分泌的调节

1．2．4 乳的组成及其功能

1．3 母猪乳腺发育及泌乳研究

1．3．1 猪乳腺发育

1．3．2 母猪泌乳研究

1．4 microRNA的研究进展

1．4．1 miRNA的发现

1．4．2 miRNA的命名

1．4．3 miRNA的生成

1．4．4 miRNA的作用机制

1．4．5 miRNA基本特征与分布

1．4．6 miRNA的靶基因预测和鉴定

1．5 本研究的目的和意义

2 利用测序技术分析金华猪和大约克猪泌乳期21天乳腺组织中microRNA的表达情况

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 miRNAs的生物信患学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 总RNA提取及质量检测

2．3．2 测序结果初步分析

2．3．3 miRNA的分类鉴定

2．3．4 miRNA进化分析

2．3．5 染色体定位分析

2．3．6 miRNA的表达差异分析

2．4 讨论

2．4．1 miRNA鉴定方法的选择

2．4．2 金华猪和大约克猪乳腺小RNA文库构建

2．4．3 miRNA的进阶分析

2．4．4 miRNA的表达差异分析

3 利用转录组测序技术(RNA-Seq)分析金华猪和大约克猪泌乳期21天乳腺组织中基因的表达情况

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 生物信息学分析

3．3 结果与分析

3．3．1 总RNA提取和质量捡测

3．3．2 RNA-Seq基本数据分析结果

3．3．3 转录组装配、鉴定与比较

3．3．4 基因表达水平分析

3．4 讨论

3．4．1 高通量测序技术

3．4．2 差异表达基因的分析

4 猪乳腺组织乳腺发育及泌乳相关基因的表达研究

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 数据处理与统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 金华猪泌乳期乳腺组织石蜡切片HE染色观察

4．3．2 大约克猪乳腺上皮细胞标记蛋白鉴定

4．3．3 金华猪和大约克猪乳腺组织中功能基因表达差异比较

4．3．3 甲基化相关基因的差异表达

4．3．4 GHR和ER蛋白表达比较

4．3．5 乳腺相关microRNA的表达比较

4．4 讨论

4．4．1 激素调控乳腺的发育

4．4．2 miRNA对乳腺发育的调控

5 金华猪乳腺上皮细胞的培养

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 数据处理与统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 乳腺上皮细胞的培养

5．3．2 乳腺上皮细胞的复苏

5．3．3 乳腺上皮细胞的鉴定

5．3．4 猪miR-148a mimics和inhibitor在乳腺上皮细胞的转染表达

5．3．5 miR-148a过表达或低表达RT-PCR验证

5．3．6 转染后细胞中基因表达水平

5．4 讨论

6 结论、创新点及研究展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

附录

博士期间论文发表

致谢