奶山羊泌乳期乳腺组织microRNA表达谱分析及miR-143调控IGFBP5对细胞作用研究

摘要

奶山羊的泌乳在整个泌乳期具有规律性，在泌乳初期泌乳量较低，随后逐渐升高达到高峰期并维持一定时间，随着泌乳的不断进行，泌乳量将逐渐下降直至干乳期。因此，了解奶山羊乳腺发育和泌乳规律，利用分子手段改善奶山羊泌乳遗传性能，以延长奶山羊的泌乳期或提高泌乳量。目前，对奶山羊泌乳规律的研究主要采用候选基因法，并发现了大量与泌乳相关的候选基因，但其参与泌乳规律的调控机制仍不清楚。
　　 MicroRNA是一类长度约22 nt的非蛋白编码的RNA，在动物的进化过程中高度保守且具有表达的时空特异性，能在转录后水平调控其靶mRNA的表达，广泛参与了细胞的增殖、分化与凋亡以及器官的发育等众多生物学过程。乳腺的发育与泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡的同期性过程。有研究表明miRNA在乳腺发育不同时期呈现差异表达模式，是乳腺发育与泌乳的重要调控因子。
　　 本研究以5只崂山奶山羊在不同泌乳时期的乳腺组织为研究材料，分别构建了泌乳初期（产后20天），泌乳高峰期（产后90天）和泌乳末期（产后210天）三个小RNA文库，采用Illumina/Solexa高通量测序技术对构建的三个文库分别进行测序，并对测序数据进行了质量检测和长度分布统计，基因组定位及小RNA分类注释，筛选出了在三个文库中差异表达的miRNA。采用生物信息学方法进一步对差异表达的miRNA进行靶基因预测、基因功能注释和KEGG通路分析。通过Solexa高通测序分析，我们发现miR-143在不同泌乳时期具有高表达丰度且呈现差异表达模式，生物信息学分析表明:其靶基因参与了乳腺的发育、细胞生长等生物学过程，采用双荧光素酶报告基因分析系统和qRT-PCR对miR-143及其潜在靶基因IGFBP5进行了靶向调控关系研究，采用MTT法、荧光Hoechst/PI双染和流式细胞术研究了miR-143对乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响。主要研究结果如下:
　　 (1)通过Solexa高通量测序，在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末期三个文库中分别获得18，031，615、19，044，002和7，385，833纯净序列读数，分别占到其高质量读数的97.88％、98.45％和73.87％。
　　 (2)小RNA长度分布统计结果表明:三个文库中小RNA序列主要分布在19-24 nt之间，22 nt序列最多，在三个文库中分别占到44.04％、41.48％和33.96％，其次为20 nt和23 nt。不同片段长度的小RNA在三个文库中呈现差异分布。
　　 (3)绵羊基因组定位分析结果表明:在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末期三个文库中分别有44，928种序列（9，093，530条读数）、69，244种序列（8，941，279条读数）和32，509种序列（3，916，179条读数）定位到绵羊基因上，分别占总序列的50.43％、46.95％和53.02％。
　　 (4)三个文库中共发现已知miRNA336个，189个呈现显著差异表达，表达丰度在1，000，000以上的有5个，let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a;在100,000-1,000,000的有10个，miR-30e-5p、miR-30d、miR-30a-5p、miR-21、miR-200c、miR-146b、miR-126、miR-103、let-7f、 let-7c。三个库中共同表达的有289个，在两个文库中共同表达的有26个，仅在一个文库中表达的有21个，其中仅在泌乳初期表达7个，仅在泌乳高峰期表达8个，仅在泌乳末期表达6个。
　　 (5)差异表达miRNA生物信息学分析表明:对189个差异表达miRNAs采用TargetScan进行靶基因预测，共获得10，325个非冗余的靶基因。通过Blast2GO和DAVID分析，有9，341个基因在GO数据库获得了功能注释，FDR＜0.05的GO注释为1，229条，显著富集的通路有68个(P＜0.05)。富集到了MAPK signaling pathway、Wnt signalingpathway、Insulin signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等与泌乳有关的信号通路。
　　 (6)三个文库中共发现50个新miRNA，对其进行生物信息学分析表明:共获得13，298个靶基因EST序列，125，846条GO注释，参与了237条通路。显著富集到Metabolicpathways、ECM-receptor interaction等与泌乳有关的通路。
　　 (7) qRT-PCR分析了miR-143及其潜在靶基因IGFBP5在三个泌乳时期的表达特征，结果表明miR-143与IGFBP5在不同泌乳时期乳腺组织表达趋势相同，均在泌乳高峰期低表达。通过构建miR-143真核表达载体，野生型和突变型IGFBP5双荧光素酶报告基因载体，体外转染奶山羊乳腺上皮原代细胞，发现miR-143靶向IGFBP53'-UTR，并正向调控其表达。
　　 (8)MTT法、荧光Hoechst33342/PI双染和流式细胞术检测miR-143对乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响，结果表明:miR-143延缓了乳腺上皮细胞周期进程，可抑制乳腺上皮细胞的增殖（P＜0.05），并促进其凋亡。
　　 (9) miR-143过表达后，与对照组相比凋亡基因BAX表达显著升高(P＜0.01)，抗凋亡基因BCL-2表达降低。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 奶山羊泌乳规律及候选基因研究

1．1．1 奶山羊泌乳规律研究

1．1．2 奶山羊泌乳性状候选基因研究

1．2 microRNA及其在动物中研究进展

1．2．1 miRNA的发现与命名

1．2．2 miRNA的生物合成与功能

1．2．3 miRNA基本特征与分布

1．2．4 miRNA的作用机制与意义

1．2．5 miRNA的鉴定方法

1．2．6 miRNA靶基因的预测与鉴定

1．2．7 miRNA在动物中研究进展

1．3 miRNA在乳腺发育及泌乳中研究

1．3．1 乳腺发育与泌乳及激素调节

1．3．2 microRNA与乳腺发育及泌乳

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物及样品采集

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 主要数据库及生物分析软件

2．2 试验方法

2．2．1 cDNA文库构建

2．2．2 Illumina／Solexa测序数据分析

2．2．3 miRNA表达谱qRT-PCR验证

2．2．4 miR-143及IGFBP5乳腺组织表达分析

2．2．5 奶山羊乳腺上皮细胞分离、纯化及培养

2．2．6 miR-143真核表达载体及IGFBP5报告基因载体构建

2．2．7 细胞转染

2．2．8 miR143与IGFBP5靶向关系荧光素酶报告基因活性检测

2．2．9 MTT法检测miR-143对细胞增殖影响

2．2．10 荧光Hoechst33342／PI双染检测miR-143对细胞凋亡影响

2．2．11 FCM检测miR-143对细胞凋亡影响

2．2．12 miR-143过表达后凋亡相关标志基因检测

2．3 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 崂山奶山羊乳腺组织小RNA文库构建及Solexa测序

3．1．1 RNA质量检测及测序文库构建

3．1．2 测序数据质量及序列长度分布特征

3．1．3 文库间公共与特有序列及基因组定位分析

3．1．4 小RNA序列的分类注释

3．2 乳腺组织中已知miRNAs的鉴定及功能分析

3．2．1 已知miRNA在不同泌乳时期的分布

3．2．2 已知miRNA碱基特性分析

3．2．3 已知miRNA差异表达分析

3．2．4 差异表达miRNA靶基因预测

3．2．5 差异表达miRNA靶基因的GO注释

3．2．6 差异表达miRNA靶基因的KEGG分析

3．2．7 差异表达miRNA聚类模式

3．2．8 已知miRNA表达qRT-PCR验证结果

3．3 乳腺组织中新miRNA鉴定及功能分析

3．3．1 新miRNA的鉴定及特征

3．3．2 新miRNA的碱基分布

3．3．3 新miRNA靶基因预测及功能分析

3．3．4 新miRNA的qRT-PCR验证

3．4 miR-143与IGFBP5靶向关系分析

3．4．1 miR-143靶基因预测及功能注释

3．4．2 miR-143与IGFBP5在不同泌乳时期乳腺组织的表达

3．4．3 miR-143表达载体及IGFBP5报告基因载体构建

3．4．4 奶山羊乳腺上皮细胞纯化及培养

3．4．5 miR-143与IGFBP5靶向关系荧光报告基因分析

3．5 miR-143对乳腺上皮细胞的作用分析

3．5．1 MTT法检测细胞增殖活力

3．5．2 荧光Hoechst33342／PI双染检测miR-143对细胞凋亡效应

3．5．3 FCM检测miR-143对细胞凋亡影响

3．5．4 FCM检测miR-143对细胞周期影响

3．5．5 凋亡相关基因表达分析

4 讨论

4．1 Solexa测序数据质量的可靠性

4．2 miRNA与其靶基因之间的关系研究

4．3 miR-143与IGFBP5调控机理

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况