重组葡聚糖磷酸化酶催化淀粉制备葡萄糖-1-磷酸

摘要

葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)有着重要的生理作用，它是糖原分解的第一个产物，可转化为葡萄糖-6-磷酸，进入EMP途径;也可与UTP反应生成UDP-葡萄糖，并进一步合成各种糖苷键。应用方面，G-1-P能阻止脂肪肝浸润，促进骨骼及牙齿中钙的累积;其铂螯合物更可用于癌症的治疗。G-1-P的生产主要是蔗糖磷酸化酶(SPase)催化蔗糖合成及葡聚糖磷酸化酶(GPase)催化可溶性淀粉合成。两者各有优缺点，就蔗糖而言，SPase是常温酶，较难工业化应用，且蔗糖中一半的碳原子转化为果糖，造成碳原子不完全利用。就可溶性淀粉而言，原料生产工艺繁琐。且两种底物价格均较高。理论上，GPase可以利用普通淀粉为原料，但是普通淀粉在常温下不能糊化，很难利用。而高温GPase催化淀粉原粉很好地解决了上述问题，成为合成G-1-P的理想方法。
　　本文工作以提高G-1-P产量及降低原料成本为出发点，将嗜热菌Pyrococcusfuriosus中编码GPase的基因在E.coli中重组表达，通过条件及反应过程优化，利用重组GPase在高温下催化普通淀粉产G-1-P。
　　将嗜热古生菌Pyrococcus furiosus(DSM3638)中编码葡聚糖磷酸化酶的基因根据已报道的序列(GenBank:1469411)对其中相对E.coli的稀有密码子序列进行优化，将优化后的基因序列进行全合成。将全合成基因连接到pET-28a(+)质粒上，构建重组质粒pET-28a-GP，转化到E.coli BL21(DE3)中，构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP，诱导表达重组葡聚糖磷酸化酶，最优诱导条件为:当培养4h时，用0.2 mM IPTG诱导，诱导后28℃培养8h。利用重组GPase的耐热性，对粗酶液高温保温处理，以此对GPase进行纯化。得到GPase纯酶的比酶活为120.57U/mg，酶活回收率为85.31％。对催化条件进行优化，得最适催化条件为:80℃、pH6.6、5％淀粉/1 M磷酸盐缓冲液。
　　考察GPase对不同淀粉的催化能力，结果表明，在80℃条件下，其对普通淀粉的转化率与可溶性淀粉相似(59％)。通过对反应过程优化，包括反应液预处理、高浓度底物催化及补料催化，最终以7.5％玉米淀粉为底物，反应16 h后补入2.5％玉米淀粉+0.2 M磷酸盐缓冲液，继续反应32 h，最终G-1-P产量达259.87mM，转化率达67.60％，高于与相同浓度的可溶性淀粉为底物的体系(252.9 mM，65.9％)。目前在GPase催化生产G-1-P的研究中，Jungdon等人以可溶性淀粉为底物，70℃条件下生产G-1-P，转化率为68.78％，这是目前报道的最高值。而本实验以淀粉原粉为底物，80℃下制备G-1-P，转化率达67.60％，与文献报道相近，但是原料成本远低于文献报道。
　　本文首次尝试利用重组GPase催化廉价易得的普通淀粉生产G-1-P，通过反应过程优化，提高G-1-P产量，与可溶性淀粉为底物相比，产量接近。表明淀粉可以替代可溶性淀粉为底物生产G-1-P，降低原料成本，同时建立了G-1-P的简单稳定的分离方法，为G-1-P的工业化生产奠定了基础。

目录

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致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 葡萄糖-1-磷酸的性质

1．2 葡萄糖-1-磷酸的功能及应用

1．2．1 葡萄糖-1-磷酸在生物体内的功能

1．2．2 葡萄糖-1-磷酸在医药方面的应用

1．3 葡萄耱-1-磷酸的生产现状

1．4 葡聚糖磷酸化酶

1．4．1 研究背景

1．4．2 GPase蛋白结构及调节机制

1．4．3 GPase催化机制

1．4．4 GPase的应用

1．5 中国淀粉现状

1．5．1 玉米淀粉的结构与性质

1．5．2 玉米淀粉的特性

1．5．3 玉米淀粉利用现状

1．6 本课题的基本思路和研究内容

第二章 材料与方法

2．1 质粒与菌株

2．2 主要试剂

2．3 实验仪器

2．4 培养基及培养条件

2．4．1 培养基

2．4．2 工程菌的培养条件

2．5 酶蛋白提取及纯化

2．5．1 酶蛋白破胞提取

2．5．2 蛋白浓度的测定

2．5．3 SDS-PAGE蛋白电泳

2．5．4 蛋白纯化

2．6 检测与分析方法

2．6．1 菌体浓度测定

2．6．2 DNS测定还原糖含量

2．6．3 GPase酶活测定

2．6．4 G-1-P浓度测定

2．6．5 反应液粘度测定

2．7 酶学性质研究

2．8 体外酶催化反应研究

第三章 Pyrococcus furiosus来源的GPase在大肠杆菌中的重组表达、分离纯化及酶学性质研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 质粒、菌株与培养基

3．2．2 工具酶及主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 GPase基因全合成

3．3．2 分子生物学相关操作

3．3．3 重组质粒构建

3．3．4 重组蛋白的表达纯化

3．3．5 GPase诱导条件优化

3．3．6 酶学性质研究

3．4 结果与分析

3．4．1 pET-28a-GP重组质粒的构建

3．4．2 GPase的诱导表达

3．4．3 GPase诱导表达条件优化

3．4．4 GPase蛋白纯化

3．4．5 重组GPase酶学性质研究

3．5 本章总结

第四章 GPase催化淀粉产葡萄糖-1-磷酸

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌体培养

4．2．2 蛋白提取及纯化

4．2．3 反应液粘度测定

4．2．4 酶催化反应

4．3 结果与分析

4．3．1 催化不同淀粉产G-1-P

4．3．2 反应体系的预处理

4．3．3 高浓度底物催化

4．3．4 补料催化

4．4 本章小结

第五章 葡萄糖-1-磷酸的分离纯化

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 反应液制备

5．2．2 G-1-P的分离纯化

5．3 结果与分析

5．3．1 大分子物质分离中乙醇添加量对G-1-P收率的影响

5．3．2 小分子物质的分离

5．3．3 磷酸盐分离过程中乙酸镁的添加量对G-1-P收率的影响

5．3．4 乙醇沉淀G-1-P

5．3．5 不同反应液中G-1-P的分离纯化

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 课题总结

6．2 课题展望

参考文献

作者简历