中华鳖IL-1β和TLR4基因的鉴定及芽孢杆菌影响中华鳖免疫功能的初步研究

摘要

中华鳖（Pelodiscus sinensis）属于爬虫纲龟鳖目，是古老的次水生爬行动物，作为变温羊膜腔动物，是变温无羊膜动物到恒温羊膜腔动物进化的联接点，对于系统发育学的研究有较高的科研价值。同时，中华鳖作为一种高营养，高经济附加值的水产品，在东南亚地区、特别是中国，其养殖规模逐年扩大，疫病也呈现逐年上升的趋势。由于对中华鳖及其病原学的基础研究相对滞后，疫病防控的措施也相对缺乏，在中华鳖养殖中也曾出现了抗生素和违禁药物滥用乱用等现象，导致药物残留等安全问题。本研究通过对IL-1β与TLR4基因的克隆研究，旨在探明它们与其他脊椎动物之间的差异，为中华鳖疾病防控，生理状态监控等提供研究基础和依据。同时探讨了枯草芽孢杆菌对于中华鳖免疫相关基因、肠道菌群以及生产性能的影响。
　　1.中华鳖IL-1β的基因克隆，功能鉴定以及成熟肽切割位点的确定
　　克隆和鉴别了中华鳖IL-1β分子(tIL-1)。序列分析结果表明，tIL-1β的cNDA全长1529 bp，包含一个61 bp的5'UTR，831 bp，编码277个氨基酸的ORF和637bp的3'UTR， tIL-1β mRNA的3'UTR的GC含量高于已知的IL-1β。tIL-1β含有IL-1家族特征序列，结构预测表明，tIL-1β的C端为一个由12个β折叠组成IL-1特征结构—β三叶草(β-trefoil)结构;同源性分析表明，tIL-1β与来自鸟类的IL-1β最为接近，核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为为46.7％和58.4％。中华鳖人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后，tIL-1β的mRNA转录水平在不同组织内均有上升，脾脏中表达量最高，在感染后6h提高20倍。通过在HEK293细胞中共表达tIL-1β和tcaspase-1，缺少经典的哺乳动物特有的ICE(Interleukin-1β cut enzyme)位点的tIL-1β能够被tcaspase-1切割。对可能切割的天冬氨酸位点进行突变，确认D130为tIL-1β的ICE位点。通过杆状病毒表达系统表达的tIL-1β成熟肽刺激中华鳖外周血单核/巨噬细胞(PBMo)可提高tIL-1β、COX-2等炎症相关基因mRNA的转录水平，说明tIL-1β具有类似哺乳动物的生物学功能。
　　2.中华鳖Toll样受体4的克隆和功能鉴定
　　TLR4是Toll样受体家族成员之一，能够识别革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖成分(Lipopolysaccharide，LPS)，并通过MyD88依赖和MyD88非依赖信号通路，诱导炎症相关蛋白和干扰素的产生。研究克隆并鉴定了来自中华鳖的TLR4分子(tTLR4)的cDNA全长序列，tTLR4全长3396bp，ORF长为2502 bp，编码一个833个氨基酸的蛋白。在蛋白质组成结构上，由3个部分组成，分别为亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat，LRR)和亮氨酸重复序列C端(LRRCT)组成的胞外区域，Ⅰ型跨膜结构域以及胞内的TIR(Toll-IL-1 receptor domain)结构域。通过与其他脊椎动物TLR4基因的氨基酸和核苷酸序列相似度比较，以及基因组的邻近基因组成分析显示，tTLR4与哺乳动物，禽类的TLR4较为接近。嗜水气单胞菌感染后中华鳖的血液和脾脏中的tTLR4 mRNA转录水平显著上升。PBMo经100 ng/ml的LPS刺激后，细胞中IL-1β，COX-2，以及tTLR4基因的mRNA水平显著上升。构建的稳定表达tTLR4的HEK293细胞经不同浓度的LPS刺激后，通过双荧光素酶实验检测发现，tTLR4可激活NF-κB启动子，但不能激活IFN-β启动子。研究结果显示，tTLR4是哺乳动物和禽类TLR4的直系同源基因，具有与哺乳动物类似的生物学功能，并能通过MyD88-依赖途径启动中华鳖机体的免疫反应。
　　3.枯草芽孢杆菌对中华鳖肠道菌群，消化酶活以及免疫相关基因的影响
　　研究了本实验室筛选得到的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对中华鳖生产性能，肠道微生态以及部分免疫相关基因的表达影响。中华鳖作为非模式动物，缺少各类模式相关(pattern recognition receptor，PRR)受体序列信息，借助于外周血转录组的De novo拼接得到的转录本，获得了12条Toll样受体基因(TLR)。饲养实验结果表明，饲料中添加枯草芽孢杆菌能够显著提高中华鳖体重，降低饲料转化率，提高肠道内的消化酶酶活。利用454测序对肠道菌群进行分析表明，中华鳖肠道的中厚壁菌门为主要优势菌群，而枯草芽孢杆菌处理后，厚壁菌的比例进一步增加，并且拟杆菌，变形门菌等革兰氏阴性菌几乎消失。利用荧光定量对肠道免疫基因进行检测发现，枯草芽孢杆菌降低炎症相关基因以及部分Toll样受体的表达。利用体外的外周血单核/巨噬细胞(PBMo)模型发现枯草芽孢杆菌对于炎症基因的激活能力低于嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），并且对嗜水气单胞菌引起的炎症反应具有一定的抑制作用。以上结果表明，日粮中添加枯草芽孢杆菌能够调整中华鳖肠道菌群结构，降低炎症基因的表达，缓解肠道应激，促进其生长。

目录

声明

摘要

主要中英文缩略表

文献综述

第一章 低等脊椎动物IL-1F研究进展

第二章 水生动物Toll样受体家族研究进展

第三章 益生菌的应用及其在对肠道免疫的影响

试验研究

第一章 中华鳖IL-1β的克隆和鉴定

1．引言

2．材料与方法

3．试验结果

4．讨论

5．小结

第二章 中华鳖Toll样受体4的克隆和功能鉴定

1．引言

2．材料与方法

3．结果与分析

4．讨论

5．小结

第三章 枯草芽孢杆菌对中华鳖肠道菌群以及免疫相关基因的影响

1．引言

2．材料与方法

3．结果与分析

4．讨论

5．小结

全文结论

创新点

参考文献

作者简介

致谢

附录