声明
致谢
摘要
缩略表
第一章 绪论
1.1 诱导多能干细胞技术及其在疾病研究中的进展
1.1.1 iPSCs构建技术及其革新
1.1.2 iPSCs研究疾病的进展
1.1.3 针对iPS细胞进行基因编辑的研究进展
1.2 iPSCs在内耳研究中的进展
1.2.1 利用iPS细胞向内耳神经细胞分化的研究
1.2.2 利用iPS细胞向内耳毛细胞分化的研究
1.3 内耳毛细胞的生理特性
1.4 几种非传统肌球蛋白在内耳毛细胞中的作用
1.4.1 MYO7A
1.4.2 MYO6
1.4.3 MXO15A
1.5 总结与展望
参考文献
第二章 MYO7A杂合双突变的耳聋患者诱导多能干细胞株建立及鉴定的研究
2.1 实验材料、仪器与试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 主要实验试剂
2.1.4 抗体
2.1.5 常用试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 尿液的收集
2.2.2 尿液细胞系的建立、培养及传代
2.2.3 饲养层(MEF)细胞的制备
2.2.4 由尿液细胞诱导为多能性干细胞
2.2.5 iPS细胞的培养、传代、冻存及复苏
2.2.6 iPS细胞全能性鉴定
2.2.7 验证构建的iPS细胞来源的正确性
2.3 实验结果
2.3.1 临床调研
2.3.2 三种来源尿液细胞系的建立
2.3.3 三种来源的iPS细胞株的建立
2.3.4 三种来源的iPS细胞株全能性的鉴定
2.4 讨论
2.5 本章小节
参考文献
第三章 MYO7A杂合双突变的耳聋患者特异iPSCs向内耳毛细胞诱导分化的研究
3.1 实验材料、仪器与试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 常用仪器
3.1.3 主要实验试剂
3.1.4 抗体
3.1.5 常用试剂配置
3.1.6 统计学方法
3.2 实验方法
3.2.1 iPS细胞向内耳祖细胞方向分化
3.2.2 iPS细胞向内耳毛细胞方向分化
3.2.3 分化细胞的基因表达检测
3.2.4 免疫荧光检测
3.2.5 鬼笔环肽标记F-actin
3.2.6 FM1-43FX染色
3.2.7 分化细胞的电镜样品处理
3.2.8 Western Blot检测
3.2.9 电生理检测
3.3 实验结果
3.3.1 正常人(C-iPS)、MYO7A杂合双突交耳聋患者(P-iPS)及其父亲来源的iPS细胞(CF-iPS)向内耳祖细胞分化情况
3.3.2 C-、CP-及CF-iPS细胞向内耳毛细胞分化情况
3.4 讨论
3.5 本章小结
参考文献
第四章 利用CRISPR技术对MYO7A杂合双突变的iPS细胞株基因修复的研究
4.1 实验材料、仪器与试剂
4.1.1 实验材料
4.1.2 常用仪器
4.1.3 主要实验试剂
4.1.4 抗体(详见第三章)
4.1.5 常用试剂配制
4.2 实验方法
4.2.1 maxGFP连入pX330
4.2.2 识别序列连入maxGFP-pX330
4.2.3 检测构建质粒的活性
4.2.4 设计ssODN
4.2.5 对P-iPS细胞进行电转染
4.2.6 转染后细胞的流式分选及后续培养
4.2.7 单细胞克隆的测序确定
4.2.8 已被矫正细胞株(CP-iPS)的另一位点测序鉴定
4.2.9 已被矫正细胞株(CP-iPS)的酶切鉴定
4.2.10 脱靶检测
4.2.11 TA克隆
4.2.12 iPS细胞的全能性鉴定、向毛细胞诱导分化及检测(详见第二、三章)
4.3 实验结果
4.3.1 将maxGFP链接pX330的实验
4.3.2 设计识别序列
4.3.3 测序确定连入打断质粒的识别序列的正确性
4.3.4 打靶质粒的活性验证
4.3.5 连接好的质粒与ssODN共转染P-iPS细胞
4.3.6 被纯合修复的阳性克隆的筛选与检测
4.3.7 对验证为基西修复正确的iPS细胞株(CP-iPS)进行全能性检测
4.3.8 将CP-iPS细胞向内耳毛细胞方向分化的实验
4.4 讨论
4.5 本章小结
参考文献
结论
攻读博士学位期间发表论文情况