固体脂质纳米粒的小肠上皮细胞转运机制研究及其载体构建

摘要

纳米给药系统在改善药物口服吸收的应用方面发展迅速，与传统的口服递药系统相比，纳米给药系统有其不可替代的优势，如给药后可以广泛地分布到胃肠道中增加药物吸收，包裹被包封的药物免受胃肠道酸性环境和酶的降解，控制药物的释放速度，通过一定的修饰可以达到靶向效果。固体脂质纳米粒(Solid lipidnanoparticels，SLNs)作为口服纳米给药系统近年来受到广泛关注，由于其制备材料为生物相容性及生物可降解性的固态脂质材料，因此被认为是最有希望开发成临床应用的纳米给药系统。虽然固体脂质纳米粒在口服给药方面显现出巨大的优势，但是其在胃肠道中的转运吸收机制的研究报道还很少。全面认识和掌握固体脂质纳米粒在胃肠道中的转运吸收机制对我们设计高效口服吸收的制剂具有重要的指导作用。本课题详细研究了固体脂质纳米粒在小肠上皮细胞单层中的转运机制，通过比较不同结构修饰的固体脂质纳米粒的转运机制差别，得出了跨膜转运效率高的固体脂质纳米粒所具有的结构特点。
　　以单硬脂酸甘油酯为脂质材料，采用水性溶剂扩散法制备了固体脂质纳米粒。以十八胺-异硫氰基荧光素(ODA-FITC)为荧光探针标记固体脂质纳米粒(ODA-FITC-SLNs)。将金纳米粒包裹到固体脂质纳米粒（Au-SLNs）中用于细胞样本的透射电镜分析。制备的三种固体脂质纳米粒的粒径相似，约为100nm，粒径均匀。固体脂质纳米粒分散液在一周的贮存期内，质量未发生明显改变。
　　体外构建MDCK细胞单层来研究固体脂质纳米粒的跨膜转运过程。加入到Transwell上室中的固体脂质纳米粒大约有20％的量摄取进入细胞单层，大约有2.5％的量实现了跨膜转运。透射电镜结果显示固体脂质纳米粒能够以完整的粒子进行跨膜转运。固体脂质纳米粒的跨膜转运对细胞单层的顶侧膜以及细胞单层的紧密连接结构没有影响。MDCK细胞对固体脂质纳米粒的摄取是一个时间和能量依赖的过程。摄取过程首先是固体脂质纳米粒粘附于细胞膜上，吸附过程会显著降低细胞膜的流动性。透射电镜结果显示细胞摄取固体脂质纳米粒是囊泡介导的过程。固体脂质纳米粒的跨膜转运主要是以网格蛋白结构、脂筏结构介导的过程，并且肌动蛋白微丝在跨膜转运过程中发挥着一定的作用。内质网、高尔基体、微管蛋白在固体脂质纳米粒的跨膜转运过程中发挥着重要作用。研究发现可能存在直接的转运途径，将固体脂质纳米粒直接由顶层膜转运至基底侧。
　　我们进一步构建了Caco-2细胞单层模型来考察固体脂质纳米粒的跨膜转运机制，并与其在MDCK细胞单层中的转运机制做了比较。首先研究了固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的细胞毒理学性质。研究结果表明，固体脂质纳米粒对Caco-2细胞的毒性较低，不会影响细胞膜的完整性，不会引起细胞的氧化应激反应，能够显著降低细胞膜的流动性。首次采用全内反射荧光显微镜技术直观地证明了固体脂质纳米粒的内吞和外排是囊泡介导的转运过程。固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的转运机制与在MDCK细胞中的大致相同，但是在Caco-2细胞中，巨胞饮途径在固体脂质纳米粒的内吞以及跨膜转运中发挥着一定的作用。固体脂质纳米粒在Caco-2细胞单层中的跨膜转运量明显低于其在MDCK细胞单层中的跨膜转运量，并且在Caco-2细胞单层中的转运是一个更依赖于能量的过程。
　　设计了不同结构修饰的固体脂质纳米粒，包括采用不同碳链长度的脂质材料以及对纳米粒表面进行不同PEG量的修饰。体外构建MDCK细胞单层，并对不同结构修饰的固体脂质纳米粒进行了跨膜转运的比较以及相应转运机制的分析。研究结果表明，随着脂质材料碳链长度的增加，固体脂质纳米粒摄取进入细胞单层和跨膜转运的量降低。跨膜转运机制分析表明，低碳链长度的固体脂质纳米粒更容易经内质网和高尔基体介导的跨膜转运途径，随着碳链长度的增加经这种转运通路转运的纳米粒的量明显减少。一定量的PEG修饰(PEG-20％)不但可以增加固体脂质纳米粒摄取进入细胞单层的量，而且可以显著增加其跨膜转运的量。其机制分析表明，一定量的PEG修饰可以增加其通过网格蛋白结构和脂筏/小窝蛋白结构摄取进入细胞单层的量，并且可以增加经直接跨膜转运途径转运的比例，减少经内质网和高尔基体介导的转运。通过大鼠的离体肠吸收和在体肠吸收实验来考察不同结构修饰的固体脂质纳米粒的跨小肠上皮转运吸收情况，结果表明其离体和在体的小肠转运吸收程度和在细胞单层中的转运结果吻合。综合体内外的研究结果，我们归纳了跨膜转运效率高的固体脂质纳米粒所具有的结构特点，即中等碳链长度的脂质材料以及适当的表面亲水性修饰可以实现固体脂质纳米粒高效地跨膜转运吸收。本课题的研究可以为固体脂质纳米粒的结构修饰和处方设计提供一定的理论指导。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第一章 固体脂质纳米粒的制备及其理化性质的研究

1．1 实验材料与仪器

1．1．1 材料

1．1．2 仪器

1．2 实验方法

1．2．1 水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒及其处方工艺考察

1．2．2 固体脂质纳米粒的标记

1．2．3 固体脂质纳米粒的理化性质研究

1．2．4 固体脂质纳米粒的稳定性研究

1．3 结果与讨论

1．3．1 水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒及其处方工艺考察

1．3．2 固体脂质纳米粒的标记

1．3．3 固体脂质纳米粒的稳定性研究

1．4 本章小结

第二章 固体脂质纳米粒在MDCK细胞单层中的转运机制研究

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 固体脂质纳米粒的制备

2．2．2 MDCK细胞的培养以及细胞单层的构建和表征

2．2．3 固体脂质纳米粒在MDCK细胞中的转运特性研究

2．2．4 固体脂质纳米粒跨上皮细胞单层转运的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 固体脂质纳米粒的制备

2．3．2 固体脂质纳米粒在MDCK细胞中的转运特性研究

2．3．3 固体脂质纳米粒跨上皮细胞单层转运的研究

2．4 本章小结

第三章 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞单层中的转运机制研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 固体脂质纳米粒的制备

3．2．2 Caco-2细胞的培养以及细胞单层的构建和表征

3．2．3 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的细胞毒理学研究

3．2．4 Caco-2细胞中荧光标记固体脂质纳米粒的量的测定

3．2．5 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的转运机制研究

3．2．6 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞单层中的跨膜转运研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 固体脂质纳米粒的制备

3．3．2 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的细胞毒理学研究

3．3．3 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的转运机制研究

3．3．4 固体脂质纳米粒在Caco-2细胞单层中的跨膜转运研究

3．4 本章小结

第四章 固体脂质纳米粒的结构修饰及其相应的转运规律研究

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 不同结构修饰的固体脂质纳米粒的构建

4．2．2 MDCK细胞培养以及细胞单层的建立

4．2．3 不同结构修饰的固体脂质纳米粒的跨膜转运机制的比较

4．2．4 大鼠外翻肠囊法研究不同结构修饰的固体脂质纳米粒的小肠转运吸收

4．2．5 结扎肠循环模型研究不同结构修饰的固体脂质纳米粒的在体小肠吸收

4．3 结果与讨论

4．3．1 不同结构修饰的固体脂质纳米粒的构建

4．3．2 不同结构修饰的固体脂质纳米粒的跨膜转运机制比较

4．3．3 外翻肠囊法研究不同结构修饰的固体脂质纳米粒的小肠转运吸收

4．3．4 结扎肠循环模型研究不同结构修饰的固体脂质纳米粒的在体肠吸收

4．4 本章小结

结论

参考文献

文献综述 口服纳米给药系统的转运吸收研究进展

作者简历