提高菜心真空渗入转基因效率的研究

摘要

真空渗入作为植物原位转化的一种方法，是白菜类作物中迄今为止所用得最多的不依赖于组织培养的转化方法。真空渗入转基因方法在白菜类作物上的应用研究虽然已有较多相关报道，但仍存在一些问题。一方面，真空渗入转化效率不稳定且普遍较低。另一方面，真空度、渗入时间、植物发育时期、农杆菌浓度、渗入介质的表面活性剂与蔗糖含量等条件以及各因素之间的共同作用对植物转化率影响程度尚不明确，使得真空渗入转化技术难以进一步扩大应用范围。
　　本研究以‘油青四九’菜心（Brassica campastris ssp.chinensis var.parachinensis‘Youqing49’）为转基因受体材料，以携带有pCAMBIA1301载体的GV3101农杆菌为供体材料，针对农杆菌菌液OD600、植株发育时期、压强与时间、表面活性剂Silwet L-77的浓度及蔗糖浓度对‘油青四九’真空渗入转化率的影响进行了单因素研究，分析各因素对转化率的影响。随后对菌液OD600、压强与时间、表面活性剂Silwet L-77的浓度及蔗糖浓度进行正交实验设计，确定菜心真空渗入转化的最佳体系。此外，通过对转基因植株上下部收种和杂交授粉实验分析原位转化在花序中发生频率较高的部位与时间。得到的主要结果如下:
　　(1)对处于三种不同发育时期的菜心进行真空渗入转化，分析发育时期对菜心真空渗入转化的影响。其中处理初花期的植株得到了约0.1％的种子转化率，高于处于现蕾期和侧薹初花期的菜心转化率，但三者并没有显著差异。处于侧薹发育期的菜心植株转化率是主薹初花期和蕾期的1.8倍和3倍，表明真空渗入处理菜心的适宜时期是侧薹发育期。
　　(2)对不同浓度的菌液处理得到的转化率分析结果表明，菌液浓度对转化事件有显著影响。在0.0025～0.4000的不同OD600处理中，菌液吸光度值在0.2时获得了高达0.12％的种子转化率。
　　(3)对不同压强和时间处理的转化率统计结果表明，压强与时间对转化效果有极显著的影响。其中压强为10 kPa，渗入处理时间为5 min时获得了最高的转化率。
　　(4)通过对表面活性剂Silwet L-77四种不同浓度的处理，发现0.0025％，0.005％，0.01％和0.02％的Silwet L-77对菜心真空渗入转化影响显著，处理菜心最适宜的浓度为0.01％。
　　(5)通过对不同的蔗糖浓度处理获得转化率的显著性分析发现，不同浓度的蔗糖处理得到的转化率差异不显著。蔗糖含量为3％时可以得到更好的转化效果。
　　(6)对影响菜心真空渗入转化的菌液浓度、渗入时间、转化介质中表面活性剂和蔗糖含量进行正交实验设计，得到适宜菜心真空渗入转化的体系为:菜心处于侧薹初花期，处理压强10 kPa，渗入时间为5.5 min，菌液吸光度值为0.2，转化介质中表面活性剂与蔗糖的含量分别为0.0125％和3％。
　　(7)通过对真空渗入转化菜心植株与野生型植株的不同杂交方式获得转化率的统计结果表明，真空渗入处理植株作为父本时，母本为野生型的植株得到了0.0039％种子转化率，远远低于真空渗入处理植株作为母本时获得的转化率，表明花粉可能通过将农杆菌转移至胚珠完成转化，但转化效率极低。通过对菜心花序上下部种子的转化率比较得知，收获的上部种子转化率高达0.133％，是下部种子转化率的1.6倍，说明农杆菌更易转化上部的花蕾，表明转化发生在花蕾发育晚期之前。
　　(8)用含有潮霉素的培养基和潮霉素浸种两种方式对转基因T1代种子进行筛选，发现培养基筛选得到的转化率是浸种法得到转化率的4倍，表明不同筛选方式对转基因效率有明显影响。

目录

声明

致谢

摘要

前言

1 文献综述：十字花科作物的农杆菌转化的研究进展

1．1 十字花科植物的农杆菌转化

1．1．1 农杆菌转化机制

1．1．2 叶盘转化法

1．1．3 农杆菌介导的原位转化法

1．2 原位转化机理与影响真空渗入转化的因素

1．2．1 原位转化机理

1．2．2 影响原位转化的因素

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 供试菌株及质粒

2．3 培养基与溶液配制

2．4 药品与试剂

2．5 仪器与设备

2．6 菜心不同发育时期的处理

2．7 不同压强与渗入时间的处理

2．8 农杆菌不同菌液浓度的真空渗入处理

2．9 不同浓度表面活性剂Silwet L-77的处理

2．10 不同蔗糖浓度的处理

2．11 不同因素的正交设计

2．12 菌液准备与真空渗入转化处理

2．13 后期管理与种子收获

2．14 潮霉素(Hyg)最佳致死浓度的确定与转基因菜心T1代种子的抗性筛选

2．15 转化株鉴定

2．16 数据处理与分析

3 结果

3．1 载体的构建与真空渗入处理转基因苗的PCR检测

3．1．1 载体的构建

3．1．2 真空渗入处理转基因苗的PCR检测

3．2 菜心不同发育时期转化效果的比较

3．3 农杆菌OD600对转化效果的影响

3．4 压强与时间对转化效果的影响

3．4．1 压强与时间对转化率的影响

3．4．2 花序浸蘸法处理菜心

3．5 不同浓度表面活性剂Silwet L-77对转化效果的影响

3．6 蔗糖浓度对转化效果的影响

3．7 最佳转化体系的确定

3．8 潮霉素致死浓度的确定和对转基因菜心T1代种子的筛选

3．9 花序中不同部位的花蕾的转化效果比较

3．10 种子转化率与植株转化率的关系

3．11 不同杂交方式的转化率比较

4 讨论

4．1 菜心发育时期对转化率的影响

4．2 菌液浓度对转化率的影响

4．3 压强与时间对转化事件的影响

4．4 表面活性剂Silwet L-77对转化率的影响

4．5 蔗糖在真空渗入菜心中的作用

4．6 转化部位与转化时间

4．7 花序浸蘸法转化菜心的可行性

4．8 转基因后代的筛选

4．9 提高农杆菌真空渗入转化率的措施

4．10 结论

参考文献