家蚕组织蛋白酶L及其特异性抑制蛋白基因对微生物诱导的免疫响应研究

摘要

家蚕既是经济价值极高的经济昆虫，也是鳞翅目模式昆虫，然而每年却因病虫害给养蚕业造成巨大的经济损失，严重影响了蚕桑产业的健康可持续发展。组织蛋白酶L是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成员，广泛分布于动物、植物、细菌、真菌、原生动物及病毒等生物体内。它在蛋白质水解过程中发挥重要作用，参与了动物体内多种生理和病理过程，如胚胎发生、激素蛋白成熟加工、细胞凋亡、免疫防御、个体发育及组织分化等。组织蛋白酶L抑制蛋白是其重要的蛋白酶抑制因子，能够与它发生可逆地竞争性结合并抑制其活性，参与蛋白质的分解代谢、感染与免疫等过程，从而保护机体免受机体本身、细菌和病毒的组织蛋白酶L的破坏性水解。然而，组织蛋白酶L及其特异性抑制蛋白在昆虫免疫中的功能及调控机制尚不清楚。
　　本研究通过对家蚕5龄第3日幼虫进行藤黄微球菌（革兰氏阳性菌）和球孢白僵菌（真菌）诱导处理，利用实时荧光定量PCR技术检测BmCtsL和BmCtsLI基因的时空表达变化，分析BmCtsL酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性，为探索组织蛋白酶及其特异性抑制蛋白的生物学功能及在防御病原微生物入侵过程中的分子机理奠定基础，并为家蚕的健康养殖研究提供理论依据。具体研究结果如下:
　　1.对家蚕幼虫进行藤黄微球菌免疫诱导12h，利用实时荧光定量PCR法检测BmCtsL和BmCtsLI基因在蚕体各组织中的表达特征，发现血细胞和脂肪体中BmCtsL和BmCtsLI基因的表达量显著上调，而其他组织中2个基因的表达量无显著变化。其中，BmCtsL基因在血细胞中的表达水平要明显高于其他组织;而BmCtsLI基因在脂肪体中的表达量最高，不仅远高于其他组织，而且也极显著高于血细胞。血细胞和脂肪体是家蚕体内重要的免疫应答组织器官，这表明BmCtsL、BmCtsLI在与免疫相关的组织中高量表达。
　　2.对家蚕幼虫分别注射藤黄微球菌和球孢白僵菌后，检测脂肪体和血细胞中BmCtsL和BmCtsLI基因在不同时间内的表达量变化。实时荧光定量PCR结果表明，家蚕脂肪体和血细胞中BmCtsL和BmCtsLI基因的表达对不同微生物的诱导响应时间存在一定差异，其中藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导BmCtsL和BmCtsLI基因的表达变化;微生物入侵后脂肪体和血细胞中BmCtsL与BmCtsLI基因的表达变化存在时间差异，具体表现为BmCtsL基因比BmCtsLI基因更先上调表达。此外，经微生物诱导后，家蚕脂肪体中的BmCtsL基因的表达响应时间明显滞后于血细胞。
　　3.通过检测家蚕幼虫经藤黄微球菌诱导处理后各组织中的BmCtsL酶活性变化，发现血细胞中的BmCtsL酶活性要明显高于其他所有组织，脂肪体、卵巢和精巢中的BmCtsL酶活性次之，表皮、中肠、中部丝腺、后部丝腺、马氏管中酶活性最低。此外，经藤黄微球菌诱导处理后，与对照组相比，血细胞与脂肪体中的BmCtsL酶活性显著上调，尤其是血细胞，而其他组织无明显变化。不同组织的BmCtsL酶活性比较结果与各组织中BmCtsL基因表达的检测结果基本一致。
　　4.对家蚕幼虫分别经藤黄微球菌和球孢白僵菌诱导处理后不同时间血细胞和脂肪体中BmCtsL的酶活性变化进行检测，结果表明在微生物诱导下家蚕血细胞中的BmCtsL酶活性不仅上升快，而且明显高于脂肪体组织;家蚕血细胞和脂肪体中的BmCtsL酶活性变化对不同微生物的诱导响应时间存在一定差异，其中藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导BmCtsL酶活性发生变化;BmCtsL的酶活性变化趋势与BmCtsLI基因的表达基本一致，但BmCtsLI基因的表达响应时间稍晚于BmCtsL酶活性的变化，推测二者之间的表达可能具有协同调控的相关性。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 家蚕先天免疫系统相关研究进展

1．2 半胱氨酸蛋白酶的研究进展

1．2．1 蛋白酶分类

1．2．2 半胱氨酸蛋白酶

1．2．3 组织蛋白酶

1．2．4 组织蛋白酶L

1．3 半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的研究进展

1．3．1 半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的类型与结构特征

1．3．2 半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的作用机制

1．4 家蚕组织蛋白酶L及其抑制蛋白的研究进展

1．4．1 家蚕组织蛋白酶L及其抑制蛋白的发现

1．4．2 家蚕组织蛋白酶L及其抑制蛋白的结构特征

1．4．3 家蚕组织蛋白酶L及其抑制蛋白的功能研究进展

1．5 本研究的目的、意义及技术路线

1．5．1 本研究的目的及意义

1．5．2 本研究的技术路线

第2章 细菌诱导下家蚕不同组织中BmCtsL和BmCtsLI基因的表达分析

2．1 材料和试剂

2．1．1 供试动物材料和实验菌株

2．1．2 工具酶和化学试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 外源菌注射5龄第3日家蚕

2．2．2 蚕体组织取样

2．2．3 家蚕总RNA的提取

2．2．4 核酸质量及浓度测定

2．2．5 反转录

2．2．6 荧光定量PCR

2．3 结果与分析

2．3．1 细菌诱导后BmCtsL基因在家蚕不同组织中的表达分析

2．3．2 细菌诱导后BmCtsLI基因在家蚕不同组织中的表达分析

2．4 讨论

第3章 细菌和真菌诱导后BmCtsL和BmCtsLI基因的时间表达谱分析

3．1 材料和试剂

3．1．1 供试动物材料和实验菌株

3．1．2 工具酶和化学试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 外源菌注射5龄第3日家蚕

3．2．2 家蚕总RNA的提取

3．2．3 核酸质量及浓度测定

3．2．4 反转录

3．2．5 荧光定量PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 微生物诱导后血细胞中BmCtsL和BmCtsLI基因的表达变化

3．3．1 微生物诱导后脂肪体中BmCtsL和BmCtsLI基因的表达变化

3．4 讨论

第4章 细菌诱导下家蚕不同组织中的BmCtsL酶活性分析

4．1 材料和试剂

4．1．1 供试动物材料和实验菌株

4．1．2 工具酶和化学试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 外源菌注射5龄第3日家蚕

4．2．2 蚕体组织取样

4．2．3 家蚕组织蛋白质浓度的测定

4．2．4 家蚕组织蛋白酶L活性检测

4．3 结果与分析

4．4 讨论

第5章 细菌和真菌诱导处理后不同时间家蚕的BmCtsL酶活性分析

5．1 材料和试剂

5．1．1 供试动物材料和实验菌株

5．1．2 工具酶和化学试剂

5．1．3 主要仪器设备

5．1．4 试剂的配制

5．2 实验方法

5．2．1 外源菌注射5龄第3日家蚕

5．2．2 蚕体组织取样

5．2．3 家蚕组织蛋白质浓度的测定

5．2．4 家蚕组织蛋白酶L活性检测

5．3 结果与分析

5．3．1 微生物诱导后不同时间血细胞中的酶活性变化

5．3．2 微生物诱导后不同时间脂肪体中的酶活性变化

5．4 讨论

第6章 总结与展望

6．1 主要总结

6．2 展望

参考文献

附表

致谢

作者硕士学习期间发表的论文