曲妥珠单抗联合唑来膦酸促进Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗骨肉瘤的实验研究

摘要

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤。采用手术、新辅助化疗等综合治疗方案后，疗效有了显著提高，但是仍有30％-50％的局部骨肉瘤终将复发;对于复发性和转移性骨肉瘤，目前尚无有效方法，疗效极差。尽管新辅助化疗结合手术已可将骨肉瘤患者的5年生存率提高到60％-80％，但近30年来患者的生存率始终没有进一步的提高。骨肉瘤的治疗现状促使科学家们探索新的致病机制和治疗手段，以进一步提高骨肉瘤的治愈率。
　　自从上世纪80年代起，免疫治疗作为继手术、化疗、放疗之后第四大治疗模式获得越来越多的重视，被视为治疗恶性肿瘤的一道曙光。我们在之前的研究中发现，Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体内体外都可以有效杀伤骨肉瘤细胞，并详细研究了可能涉及的途径和机制。因而我们考虑将Vγ9Vδ2T细胞作为骨肉瘤免疫治疗的效应细胞，探索骨肉瘤免疫治疗的新路径。
　　本次研究主要分三部分:一、我们检测分析了外周血单个核细胞在ZOL和IL-2刺激下，Vγ9Vδ2T细胞扩增表型的变化。我们发现，体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变。在体外扩增的前期，Vγ9Vδ2T细胞的杀伤作用随着数量和比例的升高而逐渐增强，并在12天至18天达到峰值。此时的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足，细胞表型为效应细胞表型，适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。二、我们研究了曲妥珠单抗TTZ介导的Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。我们发现，人类表皮生长因子受体2（HER2）的表达是TTZ结合到OS细胞上的先决条件，骨肉瘤U2OS细胞系显示中度HER2表面表达，而HOS细胞系只有低度HER2表面表达。TTZ共培养在U2OS细胞系中诱导ADCC，然而在HOS细胞系中（低HER2表面表达）没有观察到明显的ADCC效应。三、我们研究了曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。结果发现体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞具有ADCC潜能，并且它们的抗肿瘤活性可以显著地被单克隆抗体(monoantibody，mAb)共培养的肿瘤细胞所增强。TTZ是一种人源化的mAb，可以结合HER2的细胞外区域。Vγ9Vδ2T细胞联合TTZ和唑来膦酸可以对HER2阳性肿瘤细胞产生更大的细胞毒性作用。
　　因此，我们的研究结果表明，Vγ9Vδ2T细胞联合ZOL具有抑制骨肉瘤的作用，而且这种作用可以被TTZ的联合应用所增强。这项研究可以提供Vγ9Vδ2T细胞过继性免疫治疗OS，联合使用ZOL和TTZ的理论依据，为骨肉瘤的多途径联合免疫治疗提供了实验基础。
　　本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 Vγ9Vδ2 T细胞的体外扩增、纯化及表型鉴定
　　目的:
　　利用外周血单个核细胞扩增Vγ9Vδ2T细胞，分析不同时间点的表型及纯度，利用免疫磁珠纯化细胞。
　　方法:
　　将健康志愿者外周血单个核细胞使用Zol+IL-2刺激并体外扩增，流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞表型及纯度，用LDH法检测Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒活性。
　　结果:
　　健康志愿者的外周血单个核细胞经过体外培养，Vγ9Vδ2T细胞纯度、杀伤活性逐渐增加，细胞表型由幼稚型向效应性转变。体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变。12天到18天左右的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足，适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。
　　结论:
　　体外扩增Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变，表型和杀伤能力检测均表明12天到18天左右的细胞杀伤活性最佳，适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。
　　第二部分 曲妥珠单抗介导的Vγ9Vδ2 T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用
　　目的:
　　观察曲妥珠单抗能否增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。
　　方法:
　　提取健康志愿者外周血单个核细胞，利用ZOL和IL-2体外扩增14天后，流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞纯度，并检测CD16在Vγ9Vδ2T细胞上的表达情况。检测骨肉瘤细胞表面分子HER2的表达水平。应用MTS法检测曲妥珠单抗刺激Vγ9Vδ2T细胞在体外杀伤骨肉瘤细胞系HOS和U2OS的活性;流式细胞术检测共培养后Vγ9Vδ2T细胞CD107a和胞内细胞因子IFN-γ水平。
　　结果:
　　骨肉瘤U2OS细胞系显示中度HER2表面表达，而HOS细胞系只有低度HER2表面表达。在4小时MTS中观察到在0-400μg/ ml的浓度范围，TTZ无法单独抑制OS细胞的增殖，即使到72小时也一样。TTZ共培养在U2OS细胞系中诱导ADCC，然而，在HOS细胞系中（低HER2表面表达）没有观察到明显的ADCC效应。
　　结论:
　　TTZ能够增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。在U2OS细胞系可以诱发显著的ADCC效应，在HOS细胞系中没有诱发显著的ADCC效应。
　　第三部分 曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2 T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用
　　目的:
　　观察曲妥珠单抗联合唑来膦酸能否增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用，并进行Vγ9Vδ2T细胞杀伤骨肉瘤细胞的阻断机制研究。
　　方法:
　　提取健康志愿者外周血单个核细胞，利用唑来膦酸(ZOL)和IL-2体外扩增14天后，流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞纯度，并检测CD16、CD45RA、CD27在Vγ9Vδ2T细胞上的表达情况。检测骨肉瘤细胞表面分子HER2的表达水平。应用MTS法检测曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2T细胞在体外杀伤骨肉瘤细胞系HOS和U2OS的活性;流式细胞术检测共培养后Vγ9Vδ2T细胞CD107a和胞内细胞因子IFN-γ水平。应用不同阻断剂分别阻断Vγ9Vδ2T细胞以观察其杀伤骨肉瘤细胞的机制。
　　结果:
　　我们模拟临床环境肿瘤细胞使用10μM ZOL（可以达到肿瘤患者中16毫克ZOL输注达成的效果）预处理2小时，Vγ9Vδ2T细胞介导ZOL致敏U2OS目标细胞的死亡率平均为32.0％，与单独ZOL预处理组的比值为5∶1。TTZ增强了Vγ9Vδ2T细胞对ZOL致敏U2OS的细胞毒性作用，此外，TTZ明显增强Vγ9Vδ2T细胞中的CD107a表达。这些数据表明，Vγ9Vδ2T细胞介导的杀伤作用，可以进一步通过TTZ和ZOL来提高。在共培养前30分钟将抗体加入到Vγ9Vδ2T细胞。使用CMA和抗泛γδT细胞作为效应细胞的治疗中发现，Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒性是TCR依赖和穿孔素介导的（分别78.4％和83.4％的抑制率）。使用抗NKG2D抗体只能减少6.9％的细胞毒性作用，表明NKG2D不是TTZ和ZOL增强Vγ9Vδ2T细胞毒性作用的原因。
　　结论:
　　TTZ联合ZOL能够增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用，并且Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒性是TCR依赖和穿孔素介导的，NKG2D不是TTZ和ZOL增强Vγ9Vδ2T细胞毒性作用的原因。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

插图和附表清单

1 绪论

1．1 骨肉瘤的临床特点

1．2 骨肉瘤的病理分型

1．3 骨肉瘤的治疗

2 Vγ9Vδ2T细胞的体外扩增、纯化及表型鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

3 曲妥珠单抗介导的Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

4 曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

多种免疫途径联合提高ADCC抗肿瘤效应的机制研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果