Caspase-1在热惊厥发生中的作用及以Caspase-1为靶点的新型小分子抑制剂研究

摘要

热惊厥(Febrile seizures，FS)是由高热引起的惊厥发作，高发于6个月到5岁的婴幼儿，是婴幼儿时期常见的惊厥发作类型。热惊厥的发作比例为3-14％，约有70％的惊厥发作为单次短时程发作（发作时间少于15分钟），但是由于治疗手段缺乏或治疗不及时，约30％的热惊厥患者会出现复发，成为复杂性热惊厥。大量研究发现，复杂性热惊厥会在很大程度上增加罹患成年癫痫、海马硬化和认知障碍的风险。目前临床上主要利用地西泮或传统的抗癫痫药物如苯巴比妥、苯妥英等治疗小儿热惊厥，但它们只能控制惊厥发作症状而不能预防热惊厥的发生，更不能控制反复发作，且对婴幼儿具有明显的毒副作用。而传统的解热镇痛药，如布洛芬等，只能缓解发热症状，而不能控制惊厥发作。因此，探讨FS的发生机制以及寻找更为有效的药物治疗潜在靶点已成为亟待解决的问题。
　　有研究报道周期性发热综合征(Periodic Fever Syndrome，PFS)患者的血液中Caspase-1的表达水平显著上调。 Caspase-1是Caspases家族中调节炎症反应的催化酶，其以无活性的前体形式(pro-Caspase-1)存在于细胞内。当细胞受到如高温、ATP积累或钾离子外流等外界刺激时， pro-Caspase-1会与模式识别受体(PatternRecognition Receptors，PRRs)、含有蛋白酶招募节段(Caspase Recruitment Domain，CARD)的结合分子(Associated Speck-like Protein Containing CARD，ASC)组装成完整的炎症小体，pro-Caspase-1自我催化形成有活性的催化酶(即激活形式，cleaved-Caspase-1)。 cleaved-Caspase-1可剪切炎症因子IL-1β和IL-18的前体，形成成熟的IL-1β和IL-18并分泌至胞外参与一系列炎症反应。在癫痫患者和颞叶癫痫的动物模型上均检测到cleaved-Caspase-1表达水平的显著性上调。最新研究发现，Caspase-1与神经元兴奋性密切相关，在海马的锥体神经元和中间神经元上均检测到Caspase-1的表达，给予AMPA受体激动剂可以激活Caspase-1。由此，我们提出假设:Caspase-1作为热敏感的炎症因子，可能在热惊厥发生过程中起到关键作用。
　　因此，本课题采用不同温度诱导惊厥发作，探讨Caspase-1对热惊厥发生的作用，并进一步设计和筛选以Caspase-1为靶点的新型小分子抑制剂。将出生后8-10天(P8-10)的C57BL/6J小鼠放入温度为38℃，41℃或44℃的烘箱中诱导惊厥发作，观察惊厥发作症状并同步记录脑电(Electroencephalogram，EEG)。实验结果显示，幼年小鼠在41℃和44℃环境中有惊厥发作，并伴随有典型的癫痫样EEG，而在38℃中没有惊厥发作，也没有癫痫样EEG。同时发现，在41℃和44℃中，幼年小鼠海马组织内cleaved-Caspase-1的表达水平在热惊厥发作前显著性上调，同时Caspase-1的酶活性显著性升高。而在38℃中，幼年小鼠海马组织内的cleaved-Caspase-1的表达水平和Caspase-1的酶活性均无明显变化。本研究进一步发现，Caspase-1敲除小鼠（Casp1-/-）对热惊厥的发生有更低的易感性。与野生型(Wild Type，WT)小鼠相比，Casp1-/-小鼠的惊厥发作潜时延长，阈值抬高，发作比例降低。此外，在WT和Casp1-/-小鼠的海马内给予外源性Caspase-1或Caspase-1过表达的处理，幼年小鼠更易出现惊厥发作，表现为热惊厥发作潜时缩短，发作阈值降低。同时，过表达Caspase-1能够提高神经元兴奋性，反之，Casp1-/-小鼠神经元的兴奋性降低。
　　以上结果表明，Caspase-1在热惊厥发生过程中发挥重要的作用。基于Caspase-1的结构和催化位点(Cys285为酶催化位点，Arg179，Arg341，Arg383，Gln283和Gly238为选择性的天冬氨酸识别位点)，我们通过分子对接(Glidemodule in Schr(o)dinger)的计算机模拟方法设计了一系列新型小分子抑制剂。结合计算机虚拟筛选和Glide HTVS、SP、XP分子对接方法，我们筛选出144个化合物并对它们重新进行排序，排名前50的化合物进行进一步的评价和筛选。通过分子实验和细胞实验的筛选，我们发现有4个化合物（编码为6626080，6810755，9198978和7135306)对Caspase-1的酶活性具有显著的抑制作用。结合化合物的构效、结合能的能量和脂溶性分析，我们发现其中6626080不仅能够透过血脑屏障，抑制惊厥发作，降低惊厥的发作比例，而且没有明显的毒副作用。同时，电生理结果显示，海马脑片上给予6626080处理，其神经元兴奋性明显降低。进一步，我们发现6626080能够抑制惊厥的反复发作。此外，将6626080包裹到只有在高温(39℃)中才会释放的温敏胶束中，给予幼年动物预给药的处理，可以预防热惊厥的发作。
　　总之，本课题发现高热引起cleaved-Caspase-1的表达水平上调，Caspase-1通过调节神经元兴奋性，参与了热惊厥的发病机制。此外，新型的Caspase-1选择性抑制剂6626080，对热惊厥的发生具有保护作用，其可能是预防和治疗热惊厥的新的治疗策略。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 药品和化学试剂

2．3 实验仪器

2．4 实验气体

2．5 溶液配制

3 实验方法

3．1 FS的动物模型

3．2 幼鼠在体脑电(EEG)的记录及分析

3．3 免疫印迹实验

3．4 胚胎电转的质粒构建

3．5 胚胎电转

3．6 组织免疫学

3．7 人外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)的培养

3．8 MTT试验

3．9 体外电生理

3．10 小分子抑制剂

3．11 Caspase-1酶活性测定

3．12 HPLC

3．13 毒副作用的测定

3．14 p(AAm-co-AN)-PEG温敏胶束的制备、载药与测定

3．15 统计学方法

4 结果

4．1 热惊厥发作前激活的Caspase-1的表达水平上调

4．2 Caspase-1对热惊厥的发生是必要的

4．3 Caspase-1促进热惊厥的发作

4．4 新型的Caspase-1特异性抑制剂对热惊厥发作具有保护作用

4．5 温敏胶束包裹的抑制剂具有预防热惊厥发作的作用

5 讨论

6 结论和创新点

参考文献

综述

作者简历及在读期间所取得的科研成果