炎症因子和肌腱干细胞在肌腱病中的作用及干预研究

摘要

肌腱病是一种常见的软组织疾病，多发于运动员及老龄化人群。肌腱钙化及退化导致的疼痛，运动障碍及继发性骨关节炎等造成了巨大的经济和社会负担。但由于对肌腱病的发病机制了解有限，目前仍然缺少有效的肌腱病治疗手段。因此，对肌腱钙化及再生的细胞及分子机制的深入研究具有重要的理论意义和应用价值。
　　炎症对于组织损伤后的修复与再生至关重要。但是，慢性炎症导致组织器官内部稳态的破坏，参与了肿瘤、纤维化疾病、风湿性关节炎及脊柱关节炎等多种疾病的发展过程。肌腱病中多种炎症细胞及炎症因子发生了改变。但是传统的抗炎类药物，如非甾体类抗炎药(NSAIDs)和糖皮质激素，仅仅具有镇痛效果，而对于肌腱的功能恢复却没有显著的促进作用。肌腱内源性干/祖细胞具有自我更新及多向分化潜能，参与了肌腱组织稳态、修复及疾病的发生。肌腱损伤后，肌腱干/祖细胞表型改变、向软骨分化能力增强而向肌腱系分化减弱是导致肌腱修复不良及异位骨化的主要因素之一，是促进肌腱修复的潜在细胞靶点。但是，成体肌腱干/祖细胞在损伤后的炎症微环境中的再生功能如何改变及其调控的分子机制仍然有待明确。
　　近年来研究显示，急性的、可控的炎症反应不仅清除致病因素，同时调控组织内部干/祖细胞的增殖和分化以及血管形成，促进受损组织的再生。由于炎症反应所包涵的细胞和炎症因子种类繁多且功能各异，为了实现有效的组织再生，需要高度特异性地抑制炎症反应的负面作用，同时允许炎症反应发挥应有的正向的调控作用。因此，对不同时期免疫反应的性质和强度进行区分并进行其对肌腱干/祖细胞调控功能的研究，有助于进一步明确肌腱修复及钙化过程中的免疫调控机制，开发新的有效的肌腱病治疗手段。
　　本研究的目的在于:(1)研究肌腱损伤及病理发展的不同时期，各种炎症因子表达水平的变化，通过其变化趋势分析不同时期参与肌腱修复调控的主要炎症因子;(2)研究炎症因子对于肌腱干细胞(Tendon Stem/Progenitor Cells，TSPCs)功能的调控作用，明确促进肌腱再生和抑制肌腱修复的主要炎症因子;(3)在分子水平探索该炎症因子调控TSPCs分化的作用机制;(4)设计体内外实验，进一步运用小分子调控内源TSPCs功能抑制肌腱钙化、促进肌腱修复。
　　我们的研究结果分为以下四个部分:
　　一、炎症因子在肌腱病不同时期的表达谱分析
　　为明确炎症因子在肌腱病不同时期的表达变化，我们通过肌腱内部注射Ⅰ型胶原酶建立大鼠肌腱病模型，在肌腱病发展的不同阶段分别提取肌腱组织内部的蛋白，进行炎症因子表达谱分析。通过分析，我们发现肌腱损伤后1周内，组织内有大量炎症细胞浸润，同时促炎症因子白介素-1beta(IL-1β)水平显著升高;损伤后2周，抗炎症因子白介素-4（IL-4）和白介素-10(IL-10)水平上调，同时伴随炎症细胞数量减少，提示其免疫反应类型具有时期特异性。进一步分析损伤8周的慢性肌腱病组织，我们发现肌腱内部炎症细胞浸润进一步减少，但是钙化点周围促炎症信号通路NF-κB上调。另外，临床人体芯片结果显示慢性肌腱病组织与正常肌腱组织相比，促炎症因子白介素-1 al pha(IL-1α)及IL-1β有较低程度的上调，而抑炎症因子IL-4和IL-10表达下调，提示慢性肌腱病中炎症因子平衡失调。
　　以上结果显示，肌腱损伤后促炎症因子与抑炎症因子依次上调，参与了炎症的激活和消退;而慢性肌腱病中促炎症因子和抑炎症因子的平衡失调，可能参与了疾病的发展。
　　二、炎症因子对于肌腱修复及钙化的调控作用研究
　　为了探讨体内急性炎症因子水平改变对于肌腱组织及钙化的调控作用，我们分别用IL-1β(5ng/ml)，IL-4(10ng/ml，20ng/ml)、M1和M2巨噬细胞的条件培养基短期（3天）处理体外培养的肌腱组织。结果显示IL-4（20ng/ml）、M1和M2巨噬细胞的条件培养基可以维持和诱导肌腱特异的转录因子Scleraxis(Scx)的表达，而IL-1β(5ng/ml)会抑制Scx的表达。用IL-1β(5ng/ml)处理1周后，Scx表达持续降低，而TSPCs的增殖能力及软骨系转录因子Sox9表达上调;在含IL-1β诱导肌腱分化培养基中，TSPCs的腱系分化降低;在骨诱导培养条件下，碱性磷酸酶(ALP)染色增强。为了进一步明确IL-1β对于肌腱干细胞(TSPCs)的调控作用，我们对三维培养的TSPCs分别进行IL-1β(5ng/ml)5天和8天的处理后去除IL-1β并继续培养5天，结果显示短期IL-1β处理对于TSPCs中Scx表达的抑制作用为可逆性的，而IL-1β长期处理后Scx表达不可恢复。
　　综上所述，促炎症因子IL-1β促进TSPCs增殖且可逆性降低Scx表达，后期M2分泌的细胞因子，如抗炎症因子IL-4可诱导TSPCs的Scx表达，有助于肌腱修复再生;而慢性炎症中，促炎症因子IL-1β导致TSPCs的Scx表达长期下调，抑制修复性的TSPCs向肌腱系分化，促进病理性的TSPCs向骨系分化，参与了钙化性肌腱病的发展。
　　三、HIF-2α介导促炎症因子IL-1β调控TSPCs分化的机制研究
　　为了进一步明确IL-1β调控TSPCs分化的分子机制，我们对于肌腱病表达芯片进行分析，发现低氧诱导因子-2alpha（HIF-2α）显著上调。通过免疫染色，免疫印迹，实时荧光定量PCR检测显示HIF-2α在正常肌腱中低表达，而在肌腱病样本中显著上调，且HIF-2α可被IL-1β(5ng/ml)诱导。过表达HIF-2α可抑制腱系基因的表达并促进TSPCs向骨系分化，利用特异靶向HIF-2α的shRNA降低内源HIF-2α表达后，可显著抑制IL-1β(5ng/ml)处理下TSPCs的骨系分化。肌腱特异转录因子Scx转录启示序列区有几个在脊椎动物中保守的HIF-2α应答元件（HRE），过表达HIF-2α可抑制TSPCs中Scx表达，敲低HIF-2α可逆转IL-1β处理下Scx表达的降低，而过表达Scx可部分抑制过表达HIF-2α导致的TSPCs骨化增强。
　　综上所述，IL-1β通过激活HIF-2α，从而负向调控由Scx维持的肌腱系特异基因表达，上调骨软骨系基因表达，从而促进TSPCs向骨系分化增强。
　　四、运用小分子调控TSPCs功能促进肌腱再生研究
　　为了靶向调控因IL-1β慢性升高产生的炎症因子平衡破坏导致的TSPCs分化功能异常，从而促进肌腱再生，我们运用小分子阻断NF-κB和HN-2α信号通路，促进内源性TSPCs的腱系分化及肌腱再生。体外结果显示，地高辛(digoxin)可抑制炎症病理环境下HIF-2α信号通路，促进TSPCs向腱系分化，抑制其骨系分化。肌腱损伤3天后给予地高辛治疗能显著抑制肌腱异位钙化，促进肌腱修复。基因表达检测显示地高辛能够提升Scx表达水平，降低软骨特异细胞外基质胶原Ⅱ表达。提示地高辛体内也可调控内源性TSPCs向腱系分化。以往研究显示姜黄素(curcumin)可抑制NF-κB信号通路。我们的体外实验显示，IL-1β刺激下给予姜黄素处理，可促进TSPCs的增殖及维持Scx表达。肌腱损伤3天后，体内给予姜黄素治疗6周，可提升抗炎症因子IL-4和IL-10水平，下调促炎症因子IL-1α水平，体外实验显示，姜黄素处理后的巨噬细胞的条件培养基有助于诱导培养的肌腱组织的Scx表达。组织学分析显示姜黄素处理提升肌腱细胞外基质合成及胶原直径。提示姜黄素可通过直接作用于TSPCs以及间接调控炎症微环境的平衡促进肌腱修复。
　　综上所述，我们发现在肌腱损伤后的急性炎症反应时期，促炎症因子IL-1β和抑炎症因子IL-4和IL-10序贯性地上调，可促进肌腱干细胞(TSPCs)阶段性地增殖及腱系分化;而慢性病理肌腱组织中促炎症因子IL-1β长期上调而抑炎症因子IL-4和IL-10长期下调，导致炎症微环境的失衡。TSPCs的肌腱特异转录因子Scx表达下调、腱系分化能力下降但骨系分化能力增强，参与了肌腱异位钙化的形成。在机制分析中，我们通过体内外实验证明，IL-1β刺激可上调HIF-2α信号通路，抑制肌腱特异转录因子Scx及肌腱特异基因表达，从而导致TSPCs异常分化形成肌腱异位骨化。同时，我们发现运用小分子药物地高辛可调控内源TSPCs对于慢性炎症微环境的响应，抑制其骨系分化并促进其向腱系分化;而姜黄素可同时调控失衡的炎症微环境及TSPCs的表型维持，促进肌腱组织修复。
　　本课题的完成进一步明确了肌腱急性炎症反应对于肌腱干细胞的促修复性调控作用，以及慢性炎症反应中炎症因子的失衡对于肌腱干细胞的致钙化性调控作用。不仅为肌腱异位钙化提供了新的细胞及分子作用机制，同时也为靶向特定类型的免疫-肌腱干细胞作用，而开发新的抑制肌腱钙化促进肌腱再生手段提供了新的启示。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

绪论

1 第一章 炎症因子在肌腱病不同时期的表达谱分析

1．1 引言

1．2 实验试剂与仪器

1．2．1 材料和试剂(如无特殊说明均为invitrogen产品)

1．2．2 实验仪器及材料

1．2．3 相关溶液的配制

1．3 实验方法

1．3．1 大鼠跟腱肌腱病模型

1．3．2 炎症因子芯片检测

1．3．3 组织学检测

1．3．4 免疫荧光

1．3．5 统计学分析

1．4 实验结果

1．4．1 炎症因子在急性肌腱损伤中的表达谱

1．4．2 炎症因子在慢性肌腱病中的表达谱

1．5 讨论

2 第二章 炎症因子对于肌腱修复及钙化的调控作用研究

2．1 引言

2．2 实验试剂与仪器

2．2．1 仪器

2．2．2 材料

2．3 实验方法

2．3．1 hTSPCs细胞培养

2．3．2 hTSPCs功能鉴定

2．3．3 实时荧光定量PCR(real time PCR)

2．3．4 提取RNA

2．3．5 逆转录合成cDNA

2．3．6 引物设计

2．3．7 Cell Sheet诱导培养

2．3．8 骨诱导

2．3．9 免疫荧光

2．3．10 ELISA

2．3．11 巨噬细胞条件培养基

2．3．12 统计学分析

2．4 实验结果

2．4．1 促炎症因子对于肌腱修复及钙化的调控作用研究

2．4．2 促炎症因子IL-1β对于TSPCs调控的时效性

2．4．3 抑炎症因子IL-1β对于TSPCs的调控

2．4．4 巨噬细胞分泌的可溶性细胞因子对于Scx表达的调控

2．5 讨论

3 第三章 促炎症因子IL-1β调控TSPCs分化的机制研究

3．1 引言

3．2 实验试剂与仪器

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 质粒、载体及菌株

3．2．3 试剂配制

3．2．4 实验仪器及材料

3．2．5 实验动物

3．2．6 其余试剂仪器

3．3 实验方法

3．3．1 Scleraxis，Constitutive active HIF-2alpha，Dominant nagetive HIF-2alpha及shRNA逆转录病毒载体构建

3．3．2 荧光定量PCR

3．3．3 小鼠胶原酶肌腱损伤模型

3．3．4 X-RAY及microCT

3．3．5 组织学

3．3．6 低氧探针检测

3．3．7 免疫组化染色

3．3．8 Western-blot

3．3．9 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 人体及大鼠钙化样本中HIF-2α的表达显著上调

3．4．2 HIF-2α主要高表达在钙化点周围TSPCs中

3．4．3 HIF-2α的表达在IL-1β信号刺激下显著上调

3．4．4 HIF-2α参与调控IL-1β导致的TSPCs分化异常

3．4．5 HIF-2α抑制TSPCs中SCX的表达

3．4．6 HIF-2α抑制SCX表达参与了异位钙化的发生

3．5 讨论

4 第四章 运用小分子调控炎症反应促进肌腱再生研究

4．1 引言

4．2 实验试剂与仪器

4．3 实验方法

4．3．1 大鼠胶原酶损伤模型及治疗

4．3．2 细胞培养

4．3．3 Cell Sheet诱导分化

4．3．4 骨系诱导分化

4．3．5 ELISA

4．3．6 组织学检测

4．3．7 组织培养

4．3．8 透射电镜检测修复肌腱的胶原纤维微观结构

4．3．9 统计学分析

4．4 实验结果

4．4．1 地高辛体外抑制HIF-2α调控TSPCs分化

4．4．2 地高辛体内抑制HIF-2α调控肌腱修复

4．4．3 姜黄素体内外促进TSPCs的表型维持

4．4．4 姜黄素调控免疫微环境促进肌腱修复

4．5 讨论

5 总结

参考文献

综述 炎症因子调控干细胞功能及组织再生的研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果