一种耐热碱性脂肪酶基因的克隆与表达

摘要

嗜热踝节菌脂肪酶(Talaromyces thermophilus lipase，TTL)具有优异的耐热、耐碱性能，在造纸、废纸脱墨、含酶洗涤剂生产、生物柴油制备、手性化合物拆分等领域有重要的应用前景。但嗜热踝节菌自身产酶水平较低，难以实现规模化生产。本文对嗜热踝节菌脂肪酶基因进行了密码子优化，实现了该基因在毕赤酵母和里氏木霉中的重组与表达，论文取得的主要研究结果如下：
　　根据毕赤酵母表达系统的偏好性对嗜热踝节菌脂肪酶基因进行了密码子优化，将优化后的基因连接到pPIC9K载体的AOX1启动子和α信号序列之后，构建了重组表达载体pPIC9K-TTL。电击将此载体转入毕赤酵母基因组中，并通过G418抗性筛选得到了220株转化子，PCR技术检测表明外源脂肪酶基因已稳定整合到重组毕赤酵母的基因组中。对重组转化子进行摇瓶产酶实验，在1.5％甲醇诱导、初始毕赤酵母浓度为3.5×108细胞/mL、发酵液初始pH值6.0的条件下，脂肪酶活力可达到156 IU/mL。SDS-PAGE结果显示:重组子发酵液在39kDa处有一条明显的蛋白质条带，与嗜热踝节菌脂肪酶分子量一致。实验表明:嗜热踝节菌脂肪酶基因已在毕赤酵母细胞中得到了成功表达和胞外分泌。
　　对嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中的异源表达进行了研究，为外源基因在里氏木霉中的表达构建了高效的转化体系:在原生质体介导转化时，将预处理8h后的里氏木霉孢子用10 mg/mL蜗牛酶酶解1h，调整原生质体浓度为5×108细胞/mL，在PEG6000介导下进行外源基因转化可得到较高转化效率;农杆菌介导外源基因转化时，选用OD600为0.8的农杆菌EHA105和预萌发3h的里氏木霉孢子混合均匀，在添加200μM乙酰丁香酮的诱导培养基上于24℃、pH5.3环境下进行共培养，此条件下可得到较高转化效率。相比原生质体转化，农杆菌介导转化的操作周期更短，效率更高，转化子更稳定，转化子的异源蛋白表达水平也较高，是将外源基因转入里氏木霉基因组中的有效手段。
　　针对里氏木霉表达系统的密码子偏好性对ttl基因进行优化，将密码子优化后的基因插入到含有里氏木霉cbh1启动子、信号肽和终止子的表达盒中，以此构建含有潮霉素抗性标记的双元载体pCB-H-PstT。采用原生质体介导或农杆菌介导转化将重组载体转入里氏木霉细胞中，通过两步法筛选方案得到重组里氏木霉转化子。摇瓶发酵72h时重组子的脂肪酶活力可达241IU/mL。PCR和SDS-PAGE检测中可发现明显的ttl基因和相应的碱性脂肪酶蛋白条带，这表明外源ttl基因已在里氏木霉中得到成功表达和胞外分泌。
　　为了克服里氏木霉随机转化的不确定性并进一步提高脂肪酶的表达水平，对嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中的定向整合表达进行了研究。以新鲜里氏木霉菌丝的基因组DNA为模板，通过特异性引物扩增出cbh1基因的左翼(1.4kb)和右翼序列(1.5kb)，将此同源臂和脂肪酶基因表达盒PstT进行连接（总长约6kb），构建含有潮霉素抗性标记的定向整合表达载体pCB-H-LER。将此重组质粒转入里氏木霉基因组中得到里氏木霉定向整合转化子。在乳糖浓度为3％、酵母粉浓度为0.9％、pH值为5.5的条件下，转化子的脂肪酶活力可达375IU/mL，没有检测到纤维二糖水解酶活性。SDS-PAGE分析表明转化子的发酵液可检测到相应的碱性脂肪酶蛋白条带，而没有纤维二糖水解酶条带。这表明外源脂肪酶基因已经定向整合到里氏木霉cbh1基因位点上，并抑制了里氏木霉自身纤维二糖水解酶的表达，从而提高了异源脂肪酶的表达水平。
　　酶学性质研究结果表明:来源于里氏木霉和毕赤酵母的重组脂肪酶的酶学性质较为相似，重组毕赤酵母脂肪酶在pH8.0到10.5条件下具有明显的催化活性，在pH9.5催化活性最高;在40℃至70℃条件下催化活性明显，其最适反应温度为60℃;它对高温和强碱环境表现出了较强的耐受性，在60℃、pH11的条件下处理一个小时后，仍可维持最高酶活力70％以上。其催化稳定性良好，可抵抗脂肪酸聚集引起的变性。Ca2+对脂肪酶有轻微的促进作用，Na+和K+对TTL的影响不大，Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+则有较强的抑制作用。此外，TTL对乙醇、丁醇、甲醇和异丙醇表现出了较强的耐受性，但其活力受到丙酮的明显抑制。表面活性剂对TTL有一定的抑制作用，其中Tween20的抑制效果最为明显。
　　本研究成功地实现了嗜热踝节菌脂肪酶基因在毕赤酵母和里氏木霉中的克隆与表达，为耐热碱性脂肪酶的进一步规模化生产奠定了基础，相关结果具有重要的学术价值和工业应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 脂肪酶概述

1．2．1 脂肪酶的催化机理

1．2．2 脂肪酶来源

1．2．3 脂肪酶的异源表达

1．2．4 脂肪酶的应用

1．3 里氏木霉的转录调控

1．3．1 里氏木霉对不溶诱导物的识别

1．3．2 里氏木霉主要的转录调控因子

1．3．3 里氏木霉主要纤维素酶基因启动子的调控

1．3．4 里氏木霉主要半纤维素酶基因启动子的调控

1．4 里氏木霉表达体系的构建

1．4．1 里氏木霉表达载体的构建

1．4．2 里氏木霉转化体系的构建

1．5 异源蛋白在里氏木霉中的表达

1．6 提高蛋白表达水平的手段

1．6．1 整合位点和拷贝数

1．6．2 信号序列

1．6．3 密码子优化

1．6．4 融合表达

1．6．5 蛋白质量控制

1．7 本课题的研究思路及拟研究内容

第二章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 质粒与菌株

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 工具酶与试剂

2．2．4 培养基

2．2．5 嗜热踝节菌脂肪酶ttl基因的优化与重组质粒构建

2．2．6 大肠杆菌的转化

2．2．7 毕赤酵母GS115的转化

2．2．8 重组毕赤酵母转化子的诱导表达

2．2．9 测定方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 嗜热踝节菌脂肪酶基因的分析及其优化

2．3．2 毕赤酵母表达载体的构建与验证

2．3．3 重组毕赤酵母转化子的筛选

2．3．4 重组毕赤酵母转化子的PCR验证

2．3．5 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

2．3．6 重组毕赤酵母产酶条件的优化

2．3．7 重组毕赤酵母产酶进程

2．3．8 重组毕赤酵母发酵液的蛋白电泳

2．4 小结

第三章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中随机整合表达

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 质粒与菌株

3．2．2 主要工具酶与试剂

3．2．3 主要实验仪器

3．2．4 培养基

3．2．5 表达载体的构建

3．2．6 里氏木霉原生质体转化

3．2．7 质粒转入农杆菌

3．2．8 农杆菌介导转化里氏木霉

3．2．9 重组里氏木霉的筛选

3．2．10 重组里氏木霉传代稳定性验证

3．2．11 重组里氏木霉转化子的摇瓶产酶实验

3．2．12 测定方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 嗜热踝节菌脂肪酶基因序列的优化

3．3．2 里氏木霉表达载体的构建与验证

3．3．3 原生质体介导转化体系(PMT)的构建

3．3．4 农杆菌介导转化体系(ATMT)的构建

3．3．5 两种转化体系的比较分析

3．3．6 重组里氏木霉转化子的筛选

3．3．7 重组里氏木霉转化子的验证

3．3．8 重组里氏木霉转化子摇瓶产异源脂肪酶

3．3．9 重组里氏木霉发酵液的SDS-PAGE分析

3．3 小结

第四章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中定向整合表达

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株与质粒

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 主要工具酶与试剂

4．2．4 培养基

4．2．5 定向整合载体的构建

4．2．6 原生质体介导将外源基因定向整合到里氏木霉基因组中

4．2．7 重组里氏木霉转化子的筛选与鉴定

4．2．8 重组里氏木霉定向整合转化子的摇瓶产酶实验

4．2．9 测定方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 里氏木霉基因组DNA的提取

4．3．2 重组质粒pMD-L和pMD-R的构建

4．3．3 重组质粒pCB-H-LER的构建

4．3．4 里氏木霉转化子的筛选

4．3．5 里氏木霉转化子的验证

4．3．6 脂肪酶基因在重组里氏木霉中的表达

4．3．7 里氏木霉定向整合转化子产酶条件优化

4．3．8 里氏木霉定向整合转化子的发酵周期

4．3．9 里氏木霉转化子发酵液的SDS-PAGE分析

4．4 小结

第五章 重组脂肪酶的酶学性质研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 菌株

5．2．2 主要工具酶与试剂

5．2．3 培养基

5．2．4 主要实验仪器

5．2．5 发酵产酶实验

5．2．5 测定方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 重组毕赤酵母产脂肪酶的最适pH及pH稳定性

5．3．2 重组毕赤酵母产脂肪酶的最适温度及温度耐受性

5．3．3 重组里氏木霉产脂肪酶的最适pH及pH稳定性

5．3．4 重组里氏木霉产脂肪酶的最适温度及温度耐受性

5．3．5 不同来源重组脂肪酶的对pH和温度耐受性的比较

5．3．6 脂肪酶水解橄榄油动力学研究

5．3．7 金属离子对脂肪酶活力的影响

5．3．8 有机溶剂对脂肪酶活力的影响

5．3．9 表面活性剂对脂肪酶活力的影响

5．4 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

6．3 论文创新点

参考文献

作者简历

攻读博士学位期间发表的论文