甘草酸苷对小鼠免疫功能的调节作用及其抗沙门氏菌感染的机理研究

摘要

甘草酸苷(glycyrrhizin，GL)是甘草根最主要的活性成分和甜味来源，具有显著的免疫调节活性。本研究首先以小鼠为研究对象，通过体内实验探究GL对小鼠免疫功能及抗沙门氏菌感染能力的影响，随后利用体外细胞实验进一步探讨了GL对小鼠树突状细胞(dendritic cell，DC)功能成熟和巨噬细胞极化的影响，旨在阐明GL调控小鼠免疫及其抗沙门氏菌感染的作用机理;同时通过体外实验研究GL对鸡巨噬细胞免疫及清除胞内沙门氏菌能力的影响验证其免疫调节的作用效果，主要研究结果如下:
　　（一）GL对小鼠免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响
　　GL在体外对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，ST）生长和毒力基因表达的影响:50～200μg/mL GL对ST均无抑菌活性，且200μg/mL GL与ST共培养1h、2h和4h对ST毒力基因InvA、SopD、SipB、HilA和ssrB的表达无显著影响，提示GL在体外不能直接抑制ST的生长、增殖和主要毒力基因的表达。
　　GL对正常小鼠免疫功能的影响:(1)口服80 mg/kg GL在21天内对小鼠生长及回肠、结肠和肝脏组织结构无显著影响;(2)GL可显著上调小鼠回肠中sIgA的分泌，促进肠粘膜NO的合成，并提高肠粘膜、血清和脾脏中IFN-γ、IL-12、IL-6和IL-10的含量，上调肝脏中IFN-γ和IL-12的基因表达;(3)GL可提高小鼠的脾脏指数;(4)GL可上调小鼠盲肠中乳杆菌属（Lactobacillus）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、螺杆菌属（Helicobacter）和嗜胆菌属（Bilophila）的相对丰度，降低Akkermansia、拟杆菌属（Bacteroides）和Anaerostipes的相对丰度。以上结果表明，口服80 mg/kg GL对小鼠具有良好的安全性，且可改善小鼠肠道的首群结构，增强肠粘膜和机体免疫功能。
　　GL对小鼠抗ST感染能力的影响:(1)GL预防给药可显著缓解ST感染(4×108 CFU/只)引起的小鼠体重下降，改善回肠和结肠的粘膜损伤;(2)GL可显著降低小鼠回肠、结肠、脾脏和肝脏中ST的数量;(3)GL可显著降低ST感染引起的回肠、结肠、血清和脾脏中促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的含量，同时下调结肠中IL-12的分泌及肝脏中IFN-γ、TNF-α和IL-6的基因表达，而显著提高ST感染小鼠结肠、血清和脾脏中抑炎细胞因子IL-10的分泌;(4)GL可降低ST感染引起的脾脏和肝脏组织病变，显著下调肝脏caspase-1的活力，抑制ST引起的肝脏细胞凋亡;(5)GL可降低ST感染小鼠盲肠中Akkermansia、萨特氏菌属（Sutterella）、普氏菌属（Prevotella）和粪球菌属（Coprococcus）的相对丰度，提高Parabactero ides和Anae ro truncus的相对丰度。以上结果提示，GL可通过改善ST感染小鼠的肠道首群结构、提高肠道和机体的免疫功能，从而抑制ST在肠道中的定檀和向组织中的移位，改善ST感染引起的组织病变和细胞凋亡，使小鼠免受沙门氏菌感染。
　　（二）GL对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟的影响
　　本研究分别以25～200μg/mL GL处理小鼠骨髓来源树突状细胞(bonemarrow-derived DC，BMDC)，研究GL对其表型和功能成熟的影响。结果发现:(1)GL对小鼠BMDC的安全浓度范围为0～400μg/mL;(2)25～200μg/mL GL以浓度依赖的方式显著降低BMDC胞内ACP的活力;(3)GL可显著上调BMDC中成熟标志分子CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-Ⅱ的表面表达及细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的基因表达和分泌;(4)GL可在12h内显著上调BMDC中TLR2的基因表达，降低TLR3和TLR4的基因表达;(5)GL可在60 min内激活BMDC中NF-κB、ERK和p38 MAPK信号分子，并介导IL-12和IL-6的分泌。以上结果提示，GL能够通过TLR激活NF-κB、ERK和p38 MAPK信号通路，促进BMDC成熟，提高其抗原递呈能力和免疫功能。
　　（三）GL对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的影响
　　本研究以100μg/mL GL处理小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derivedmacrophage，BMDM)，研究GL对其极化、功能及信号通路的影响。结果发现:(1)GL对小鼠BMDM的安全浓度范围为0～100μg/mL;(2) GL可显著上调BMDM中CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表面表达，表明GL能够激活小鼠BMDM，增强其抗原递呈能力;(3) GL可显著上调BMDM中M1型巨噬细胞特征分子CCR7、TNF-α、IL-12和IL-6的表面表达或分泌，降低M2型巨噬细胞特征分子Ym1和MR的基因表达，提示GL能够诱导BMDM向M1型极化;(4)GL可在24 h内显著上调BMDM中iNOS的基因表达，下调Arg1的表达，并诱导iNOS的蛋白表达和NO的合成，表明GL能够促进BMDM中NO的合成，提高细胞的抗感染能力;(5)GL可增强BMDM吞噬FITC-Dextran和E.coli K88的能力，并显著降低ST和E.coli K88在细胞内的存活，表明GL能够增强BMDM的吞噬、杀菌能力;(6)GL在60 min内不能激活BMDM中STAT1信号分子，可激活NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK信号分子，其中NF-κB和JNK介导了BMDM中M1型特征分子NO和IL-6的产生，而ERK介导了IL-10的分泌，表明NF-κB和JNK信号通路参与了GL诱导的M1型巨噬细胞极化，而ERK通路通过调节抗炎细胞因子IL-10的分泌对上述过程进行调控;(7) GL可显著下调IL-4诱导的M2型巨噬细胞特征分子Arg1、FIZZ1、MR和Ym1的基因表达，提示GL能够抑制IL-4诱导的M2型巨噬细胞的产生;(8)GL可显著上调IL-4诱导的M2型巨噬细胞表达M1型特征分子iNOS、TNF-α、 IL-12p40和IL-6，提示GL可促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞向M1型转化;(9)GL可显著下调IL-4诱导的M2型极化相关信号分子PPAR-γ和KLF4的基因表达，提示GL可能通过降低PPAR-γ和KLF4的表达，抑制IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化。
　　（四）GL对鸡HD11巨噬细胞系免疫功能的影响
　　本研究以100μg/mL GL处理鸡HD11巨噬细胞系，研究GL对其免疫功能的激活情况。结果如下:(1)GL对鸡HD11巨噬细胞系的安全浓度范围为0～400μg/mL;(2)GL可显著增强HD11细胞吞噬FITC-Dextran和ST的能力，显著降低胞内ST数量;(3)GL在12h内可显著上调HD11细胞表面分子CD40、CD80、CD83和CD197及细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10的基因表达;(4)GL可显著提高细胞中iNOS和NOX-1的基因表达以及NO和H2O2的产生水平。上述结果表明，GL能够激活鸡HD11巨噬细胞系，提高其吞噬、杀菌和抗原递呈能力。
　　综上所述，50～200μtg/mL GL不具备直接杀死和抑制ST生长的能力，其主要通过激活小鼠DC和巨噬细胞，促进DC功能的成熟和巨噬细胞的M1型极化，改善肠道菌群结构和提高免疫功能等途径增强小鼠抗ST感染的能力。同时本研究还发现GL能够激活鸡HD11巨噬细胞系，提高其吞噬和杀灭胞内ST的能力。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 甘草的研究进展

1．1 简介

1．2 活性成分

1．3 药理作用

2 甘草酸苷的研究进展

2．1 结构与分类

2．2 生物活性

2．3 药代动力学

2．4 副作用和安全性研究

3 沙门氏菌的简介

3．1 沙门氏茵的毒力岛

3．2 沙门氏菌感染与肠道免疫反应

4 树突状细胞(DC)的成熟与功能

4．1 DC的来源和分类

4．2 DC的成熟

4．3 TLR信号在DC成熟中的作用

5 巨噬细胞的极化

5．1 巨噬细胞的来源和分类

5．2 巨噬细胞的极化类型

5．3 巨噬细胞极化相关的信号通路

5．4 病原微生物对巨噬细胞极化的调控

6 本研究的目的和意义

第二章 甘草酸苷对小鼠免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验动物

2．3 实验菌株

2．4 实验试剂

2．5 所用试剂的配制

2．6 主要仪器和设备

3 实验方法

3．1 沙门氏菌的培养与准备

3．2 体外抑菌实验

3．3 小鼠体内实验

3．4 数据分析

4 结果与分析

4．1 GL对ST的体外抑菌效果

4．2 GL对小鼠免疫功能和抗ST感染能力的影响

5 讨论

5．1 GL在体外对ST的抑菌效果

5．2 GL对正常小鼠免疫功能的影响

5．3 GL对小鼠抗ST感染能力的影响

6 小结

第三章 甘草酸苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验动物

2．3 实验试剂

2．4 主要仪器和设备

3 实验方法

3．1 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养与鉴定

3．2 细胞毒性检测

3．3 细胞内ACP活性检测

3．4 树突状细胞成熟相关的表面标志分子的表达

3．5 树突状细胞细胞因子基因表达的检测

3．6 树突状细胞细胞因子分泌的检测

3．7 树突状细胞TLR受体及MyD88和TRIF表达的检测

3．8 树突状细胞成熟相关信号通路的检测

3．9 信号阻断实验

3．10 数据分析

4 结果与分析

4．1 GL对小鼠BMDCs的安全性

4．2 GL对小鼠BMDCs细胞内ACP活性的影响

4．3 GL对BMDCs成熟相关表面标志分子表达的影响

4．4 GL对BMDCs细胞因子基因表达的影响

4．5 GL对BMDCs细胞因子分泌的影响

4．6 GL对BMDCs TLR受体及MyD88和TRIF表达的影响

4．7 GL对BMDCs中MAPKs和NF-κB信号通路的激活

4．8 信号阻断对GL诱导的IL-12p70和IL-6分泌的影响

5 讨论

6 小结

第四章 甘草酸苷对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验动物

2．3 实验试剂

2．4 主要仪器和设备

3 实验方法

3．1 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离与培养

3．2 细胞毒性检测

3．3 BMDM极化相关的检测

3．4 影响IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化的检测

3．5 数据处理

4 结果与分析

4．1 GL对小鼠BMDMs的安全性

4．2 GL对小鼠BMDMs的激活

4．3 GL对小鼠BMDMs极化的影响

4．4 GL对IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化的影响

5 讨论

6 小结

第五章 甘草酸苷对鸡HD11巨噬细胞系免疫功能的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验细胞

2．3 实验试剂

2．4 主要仪器和设备

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 细胞毒性检测

3．3 吞噬功能的检测

3．4 清除沙门氏菌能力的检测

3．5 HD11活化相关分子基因表达的检测

3．6 H2O2产生的检测

3．7 NO合成的检测

3．8 数据分析

4 结果与分析

4．1 GL对鸡HD11细胞的安全性

4．2 GL对鸡HD11细胞吞噬功能的影响

4．3 GL对鸡HD11细胞表面分子基因表达的影响

4．4 GL对鸡HD11细胞清除沙门氏菌能力的影响

4．5 GL对鸡HD11细胞产生NO和H2O2的影响

4．6 GL对鸡HD11细胞细胞因子表达的影响

5 讨论

6 小结

第六章 结论、创新点和研究展望

参考文献

致谢

个人简介