栽培杨梅谱系地理、驯化起源及品种（系）间关系的研究

摘要

杨梅（Morella rubra Lour.）属杨梅科(Myricaceae)杨梅属（Morella Lour.），是一种特产于中国的著名水果，自然分布于中国和邻近的东亚各国。杨梅属在中国分布有4个种，分别为杨梅、毛杨梅（M.esculenta）、青杨梅（M.adenophora）和云南杨梅（M.nana），其中只有杨梅被驯化为水果。我国的野生杨梅群体分布很广，在华东、华南至西南11个省区均有存在，是栽培杨梅的主要种质资源库。栽培杨梅在中国驯化已有2000多年，目前已形成浙江、江苏、福建、广东等多个主要栽培区。目前，关于杨梅系统地位、野生杨梅群体遗传结构及历史动态、栽培杨梅的驯化起源及品种间关系一直没有得到很好解决。本研究在前人研究基础上，基于二代高通量测序中的简化基因组测序技术RAD-seq研究了杨梅的系统地位;通过对杨梅叶绿体全基因组分析，基于筛选的具有多态性的cpDNA片段，并结合核SSR及RAD-seq分子标记分析了野生杨梅群体的遗传多样性及历史动态、栽培杨梅的驯化起源以及不同杨梅栽培品种（系）之间的关系。得到的以下主要创新性研究结果:
　　(1)杨梅的系统地位及种间、种内分化历史
　　利用二代高通量RAD-seq测序技术对供试样品在全基因组水平上进行扫描，共筛选到了4253个基因座含有8360个简约性信息位点和3677个非连锁SNP位点。以北美香蕨木（Comptonia peregrina）为外类群，利用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯推断法(BI)构建了系统发育树，揭示在中国4个种中，支持毛杨梅位于基部，杨梅和青杨梅形成了很好的姐妹群关系，再与云南杨梅构成支持率很高的单系;结果同时揭示杨梅属在北美分布的种类（M.cerifera和M.pensylvanica）与东亚物种形成了间断分布的姐妹群关系。
　　利用BEAST对种间、种内分化时间进行估算，用两个二次校正点进行校正，推测杨梅属中国4个种的分化是在12.72 Ma完成的，杨梅（Morella rubra）的物种形成时间大概在中新世与上新世的交界处(5.28 Ma)，到上新世晚期(3.39 Ma)杨梅种内开始分化。杨梅种内的分化以及向东向北迁移很可能是由喜马拉雅山脉隆升引发横断山脉的形成而导致中国南亚热带生态环境的剧变所引起的。
　　通过对杨梅不同群体4个个体的一致性序列进行比对，在杨梅种内筛选到了3808个非连锁SNP位点，为进一步解析野生杨梅的群体遗传结构、亲缘地理以及栽培杨梅的驯化起源提供一个有效的分子工具。同时，对原始数据中不含酶切位点序列进行拼接、组装和注释后，通过与公共数据库比对，获得了与杨梅果实成熟与衰老、果实品质和疾病/防御相关的基因以及所涉及的信号通路。
　　(2)杨梅叶绿体基因组测序及分析
　　基于前人叶绿体基因间隔区psb A-trnH构建的单倍型网络图，从中选取分别代表广布单倍型H1、单倍型H3和H4的三个杨梅个体进行了叶绿体全基因组测序。平均每个样品得到4.76G的原始数据，reads长度为125 bp，碱基质量超过Q20的百分比介于93.14％-93.45％之间。通过组装、拼接后三个杨梅个体的叶绿体基因组全长分别为159，440bp、159，612bp和159，567bp。
　　杨梅叶绿体基因组的测序、注释及序列分析结果表明:该叶绿体基因组呈闭合环状，与大多数被子植物基因组结构一样，整个基因组共由4部分组成:一个大单拷贝区（LSC，Large Single Copy region），一个小单拷贝区(SSC，Small SingleCopy region)，两个反向互补重复区(IRs， Inverted Repeat regions)，GC含量大约占36.1％。在整个叶绿体基因组中共定位到117个不同的基因，其中74个蛋白质编码基因，32个不同tRNA编码基因，4个rRNA编码基因，4个保守开放阅读框和3个假基因。将三个杨梅叶绿体基因组比对后，共检测到322个变异位点，其中单核苷酸多态性位点(SNP)有272个，插入-缺失变异(indel)49个，通过对SNP位点筛选及引物设计，共得到了9个可用于杨梅群体遗传结构、亲缘地理分析的cpDNA片段。
　　(3)杨梅野生群体遗传多样性、遗传结构及进化历史分析
　　基于9对SSR分子标记以及从上述9个cpDNA片段中筛选的4个cpDNA片段，分析了杨梅野生群体的遗传多样性和遗传结构。核SSR结果显示，杨梅的遗传多样性总体处于中等水平（Ho=0.615，HE=0.472）。基于cpDNA序列变异在杨梅野生群体中共检测到53个变异位点，其中51个单点突变和2个插入缺失，共获得了17个单倍型。相对于核SSR水平，杨梅野生群体在cpDNA水平上具有较低的遗传多样性（h=0.195，π=0.0.000325）。线性回归分析表明，仅核苷酸多态性(π)随着纬度的升高而降低（r=0.170，p=0.036）呈现较为明显的负相关，其它遗传多样性参数与经纬度没有存在明显的相关性。
　　AMOVA分析显示，在cpDNA水平上，杨梅野生群体间(88.17％)的遗传分化大于群体内(11.83％)，而在核SSR水平上群体间(18.89％)的遗传分化小于群体内(81.11％)。基于核SSR（FST=0.189）和cpDNA（FST=0.882）群体间的遗传分化指数得出Nm值分别是1.07和0.07，而杨梅野生群体间的花粉流和种子流之比为30，表明杨梅群体间的基因流以花粉流为主。
　　首次利用RAD-seq对野生杨梅群体间亲缘关系进行了分析，从供试样品中共筛选到了83，225个非连锁SNP位点。结合cpDNA和核SSR的分析结果，显示西南地区为杨梅在中国大陆的祖先分布区，云南的野生杨梅具有祖先群体的特征。失配分布(MDA)分析显示杨梅野生群体没有发生过群体扩张，但单倍型网络图表现出有群体扩张信号。地理隔离效应(IBD)分析显示杨梅群体遗传分布格局和地理分布模式没有显著的相关性，与杨梅为风媒传粉植物相吻合。但是，cpDNA单倍型的谱系地理揭示其多态性主要分布在南岭以南的南亚热带地区，南岭以北的华中和华东分布的野生杨梅的单倍型比较单一，值得进一步研究。
　　(4)杨梅栽培群体遗传多样性、驯化起源及品种（品系）间的关系
　　基于9对SSR分子标记对杨梅野生和栽培群体的遗传多样性及遗传结构进行了分析，从基因多样性（Hs）、等位基因丰富度(AR)、期望杂合度（HE）、观察杂合度(HO)以及特有等位基因丰富度（PR）来说，杨梅野生群体的遗传多样性略高于栽培群体，表明在驯化过程中受到了一定的人工选择。基于RAD-seq全基因组扫描得到结果揭示栽培杨梅与野生群体分化已明显，作者认为栽培杨梅就近取材引种、再通过长期营养繁殖保持农艺性状是造成此现象的原因。
　　基于核SSR和RAD-seq两种不同的分子标记对栽培杨梅驯化起源进行了分析。研究结果表明，两种分子标记共同揭示栽培杨梅在中国经历了多次相对独立的驯化事件。揭示浙江栽培群体经历了两次驯化过程，福建栽培群体是单独驯化起源的，江苏的部分栽培品种（品系）是外地引入的;来自于不同主栽区的‘东魁’品种是由一次独立驯化事件完成的;结合人类“就近驯化”的习惯，提出目前主要栽培杨梅品种（品系）是分别来源于浙江、江西、福建等地的野生群体，并且是经过多次引种驯化完成的。
　　同样，利用核SSR和RAD-seq分子标记并结合果实性状（农艺特征）对栽培杨梅不同品种（品系）间的关系进行了分析。研究表明，RAD-seq由于能够提供更多的信患位点，因而揭示的结果比核SSR、1SSR、RAPD等标记的结果更加清晰可靠，栽培杨梅不同品种间的亲缘关系与品种原产地之间有比较大的相关性，大部分相近产地的不同品种（品系）表现出共同的种质遗传基础;所收集到的39个品种在NJ树上被分为4个谱系，经省级鉴定的12个品种在每个谱系中都有分布，其中谱系1和谱系2各含有一个品种，分别为‘乌酥’和‘八贤道’，谱系3包含有‘东魁’和‘丁岙’，谱系4可分为2个分支，其中第1个分支包含‘早色’、‘大叶细蒂’、‘小叶细蒂’和‘乌梅’，而‘早荠’、‘晚稻’、‘晚荠’和‘荸荠’被分在第2个分支内;结合果实性状（农艺特征）分析显示，东魁是遗传和形态上相对稳定的品种，苏州‘大叶细蒂’(SZDY)和‘小叶细蒂’(SZXY)，台州‘桐子’(TZTZ)和临海‘早大种’(LHZD)，福建‘浮宫l号’(FJFG)和‘特早梅’(FJTZ)，杭州‘早色’(HZZS)、上虞‘深红’(SYSH)和余姚‘粉红’（YYFH）等在遗传上较近的品种也具有了比较稳定的果实性状特征。
　　本研究已全面揭示了现有杨梅（M.rubra）野生群体和栽培品种（品系）种质遗传结构和谱系关系，为杨梅新种质创制、可持续利用奠定了基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第1章 前言

1．1 被子植物分子系统学研究进展

1．2 植物群体遗传及亲缘地理学概述

1．2．1 植物群体遗传学

1．2．2 植物亲缘地理学概述

1．3 栽培植物驯化起源研究

1．3．1 植物驯化起源概述

1．3．2 分子标记在植物驯化起源中的应用

1．4 杨梅的研究概况

1．4．1 物种介绍及其研究现状

1．4．2 杨梅种质遗传及品种间关系研究

1．4．3 存在的问题和研究意义

1．4．4 研究内容和目的

第2章 野外调查与采样

2．1 资源调查与采集方法

2．2 野外调查及采样结果

2．2．1 野外调查及形态学描述

2．2．2 野外采集结果

第3章 杨梅属中国种类的系统位置及分化时间研究

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果分析

3．2．1 基因组DNA提取及检测

3．2．2 RAD标签生成及De novo组差

3．2．3 系统发育关系及分化时间估算

3．2．4 序列注释及GO富集分析

3．3 讨论

3．3．1 杨梅及其近缘种亲缘关系及分类

3．3．2 青海-西藏高原(QTP)第三次隆起与杨梅种内分化

3．3．3 基于RAD-seq对杨梅遗传资源的开发

3．4 小结

第4章 杨梅叶绿体基因组测序与组装

4．1 材料

4．2 方法

4．2．1 基因组总DNA提取

4．2．2 文库的制备和测序

4．2．3 叶绿体基因组拼接与组装

4．2．4 叶绿体基因组注释

4．2．5 叶绿体基因组SNP及SSR分子标记开发

4．3 结果

4．3．1 测序结果分析

4．3．2 叶绿体基因组拼接与组蓑

4．3．3 基因注释结果

4．3．4 SNP及SSR分子标记开发

4．4 讨论

4．1．1 基于Illumina测序平台对杨梅叶绿体基因组的组装

4．1．2 杨梅叶绿体基因组结构特征

第5章 野生杨梅群体遗传及亲缘地理研究

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 基因组DNA提取

5．2．2 基于RAD-seq对杨梅野生群体亲缘关系的分析

5．2．3 基于cpDNA序列变异的群体遗传和亲缘地理分析

5．2．4 基于SSR杨梅群体遗传结构及动态历史分析

5．3 结果分析

5．3．1 基于RAD-seq对杨梅野生群体亲缘关系的研究

5．3．2 cpDNA序列的测序结果

5．3．3 基于cpDNA的单倍型谱系关系分析

5．3．4 SSR引物筛选及评价

5．3．5 基于cpDNA和SSR的群体遗传多样性

5．3．6 基于SSR的群体遗传结构分析

5．3．7 群体历史动态分析

5．4 讨论

5．4．1 野生杨梅的群体结构、亲缘地理及历史动态

5．4．2 野生杨梅群体的遗传多样性及其种质资源利用与保护

5．5 小结

第6章 基于SSR和RAD-seq标记对栽培杨梅驯化起源及品种(系)间关系研究

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 基因组DNA提取

6．2．2 基于SSR分子标记对栽培杨梅驯化起源及品种间关系研究

6．2．3 基于RAD-seq对栽培杨梅驯化起源及品种间关系研究

6．2．4 栽培品种(系)形态和农艺性状分析

6．3 结果

6．3．1 栽培杨梅各品种(系)农艺性状统计

6．3．2 基于SSR分子标记的栽培杨梅与野生杨梅的群体遗传多样性分析

6．3．3 基于SSR分子标记的群体遗传结构及群体间基因流分析

6．3．4 基于RAD-seq的杨梅群体间亲缘关系分析

6．3．5 不同杨梅栽培品种(系)之间的关系

6．4 讨论

6．4．1 驯化对杨梅遗传多样性及群体遗传结构影响

6．4．2 栽培杨梅的驯化起源

6．4．3 不同杨梅品种(系)间的关系

6．5 小结

第7章 总结与展望

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

附录

在读期间的主要成果

致谢