脂肪酶高产菌的选育、酶的纯化和表征以及两种诱导方式产酶的机理研究

摘要

脂肪酶是一种既可催化水解反应又可催化合成反应的生物催化剂。因微生物脂肪酶的产量高，便于基因操作，生产无季节波动等原因，比植物和动物来源的脂肪酶的应用更为广泛。本研究依靠罗丹明B橄榄油初筛培养基从5份土样中筛选到16株细菌和16株真菌。通过测定发酵液酶活和专一性，对菌株进行复筛，并利用SHERLOCK(R)全自动微生物鉴定系统、26～28S rDNA或ITS序列测定等方法进行鉴定。复筛出7株产酶较优菌，其中Pseudomonas sp.B1-1、Acinetobacter sp.B1-2、Acinetobacter sp.B5-1、Trichosporon sp.F1-2为sn-1(3)位专一性，Staphylococcus sp.B2-1、Acinetobacter sp.B3-8和Galactomyces candidumF1-1无专一性。所有分离菌中T.sp.F1-2的酶活力最高，因此选为重点研究对象。系统发育分析显示其与T.cacaoliposimilis和T.laibachii的进化关系最近。
　　研究发现，T.sp.F1-2的胞外比酶活高于胞内，所以更有利于纯化。通过50％饱和度的硫酸铵沉淀、8000～14000Da透析和DEAE-sepharose FF弱阴离子交换柱层析(pH8.3)的纯化步骤，将T.sp F1-2脂肪酶纯化了3.96倍，比酶活达到223.13 U/mg，经过SDS-PAGE分析，测得其分子量为32.6kDa。本论文详细研究了T.sp F1-2脂肪酶的性质。该酶能长期耐受的最高温度为45℃，短期最适反应温度为50℃，其最适保藏pH范围为7.0～9.0，最适反应pH为8.0。该酶具有sn-1(3)位专一性。其对底物的链长也具有明显的选择性，最优的底物是辛酸酯;该酶在Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Mn2+等金属离子中酶活稳定性较好，Zn2+是其最强的酶活抑制剂。该酶对各种类型的表面活性剂都很敏感，但对非离子型表面活性剂的耐受性稍好于阴离子表面活性剂。该酶对多种有机溶剂都表现出非常突出的耐受性，乙醚、二氯甲烷、甲苯和正己烷还能一定程度上提升其酶活，其对强极性试剂丙三醇、二甲基亚砜和甲醇的高耐受性在脂肪酶中较少见。
　　深入研究了两种诱导方式，即外加诱导油和自身合成油脂分别为产酶诱导物。当添加诱导油发酵时，菌体会转运诱导油到胞内，形成球状的脂质体，并且在转运前先将诱导油乳化成极小的油滴，以便于转运。低浓度葡萄糖发酵时，由于第一碳源很快耗尽，转运在发酵24h时已经很显著。高浓度葡萄糖发酵时，虽然并不缺乏葡萄糖，也会在稍晚于低浓度发酵一段时间后开始快速转运油脂，形成大量脂质体，这很可能便是高糖发酵时产酶仍维持高水平的原因。经过脂肪酸组成分析确认，诱导油发酵时，胞内脂质体的脂肪酸组成与诱导油一致，确系来自胞外转运，这与葡萄糖的初始浓度无关。当不添加诱导油发酵时，该菌仍会通过转化葡萄糖形成较多的脂质体。由于合成脂类需要脂肪酶参与，且合成后积累在体内又成了自产的诱导油，进一步促进脂肪酶的生成，因此，即使不添加诱导油，该菌也能生产一定量的脂肪酶。该菌自产的脂类主要含五种脂肪酸:肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸。降低发酵培养基中的氮源浓度，有利于油脂积累，且会影响脂肪酸的组成，使得饱和脂肪酸的含量增加，不饱和脂肪酸的含量减少。对比两种诱导途径，直接添加诱导油发酵产酶的效率要高于自身产油诱导的效率，且采用前种发酵时，从种子培养就开始添加诱导油会显著提高产酶量，而对于后种发酵，种子培养基中添加油并不会提高胞外产酶。
　　生产能力偏低是限制T.sp F1-2实现工业化生产的主要原因。于是利用常压室温等离子体对野生菌进行了诱变处理，并建立了96孔板培养结合对硝基苯酚棕榈酸酯法测定酶活力的高通量筛选方法，实现了60个突变菌株的初筛。以酶活力为筛选指标时，突变率和正突变率分别为51.7％和28.3％。8株初筛菌株的摇瓶发酵结果显示，A13和A5的产酶提高最显著，培养96h后分别比野生菌增加2.64倍和1.54倍，且两个突变菌株的遗传稳定性良好。进一步的对比研究发现，突变菌株A13相较野生菌的最大优势在于提前24 h便能达到最高产酶量。
　　本论文还利用商业化酶制剂研究了脂肪酶的两种重要特性，位置专一性和酰基迁移。脂肪酶的位置专一性在结构酯的合成和油脂改性中具有重要意义。由于水体系和非水体系的差异，传统的水解判定法得出的专一性与该酶在合成反应中的表现可能并不一致。于是建立了利用月桂酸和山茶油的酸解反应来直接评估酶在无溶剂体系中位置专一性的方法。利用此方法，Lipozyme RM IM、L02、L03和L04被鉴定为sn-1(3)位专一性，L01为弱专一性，Novozym435近似无专一性。通过替换酶的底物，模型反应的可预测性得到验证。根据酸解法和水解法结果的对比分析，两种条件下酶的位置专一性通常是相同的，除了易受到溶剂体系影响的Novozym435。因此，新方法能够避免水解判定结果在合成反应中应用的局限性。
　　除了酸解反应模型，还建立了一个酯交换反应模型来研究酰基迁移的影响因素。模型反应的底物为等摩尔量的三月桂酸甘油酯和1，3-棕榈酸-2-油酸甘油酯，三种固定化脂肪酶参与了此反应。通过测定甘油三酯的组成和脂肪酸的分布来检测sn-1(3)位的酯交换和sn-2位的酰基迁移。固定化于聚丙烯的Rhizopus oryzae脂肪酶表现出非常严格的sn-1(3)位专一性，2位发生的改变非常小。而固定化于二氧化硅的Thermomyces lanuginosus脂肪酶(Lipozyme(R)TL IM)能在24h内完成完全的随机化。固定化于聚丙烯的T.lanuginosus脂肪酶能催化2位发生中等程度的改变。因此，T.lanuginosus脂肪酶和二氧化硅会促进脂肪酸分布的随机化，而R.oryzae脂肪酶和聚丙烯则不会。高水分活度促进水解因此会增加不完整甘油酯的浓度，但同时也会抑制这些中间产物的的酰基迁移，最后的结果是，当酯交换率的程度相同时，不同水分活度下2位的酰基迁移没有显著差异，而低水分活度的主要优势是能保证甘油三酯的产量。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 脂肪酶的结构和催化机理

1．2 微生物脂肪酶的优势和筛选方法

1．3 脂肪酶纯化的难点和研究进展

1．4 脂肪酶的表征

1．4．1 常见性质

1．4．2 位置专一性和酰基迁移

1．5 Trichosporon sp．产脂肪酶和油脂的研究进展

1．6 本论文的研究思路

第二章 高产脂肪酶菌株的筛选及菌种鉴定

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 土壤样品

2．2．2 主要试剂

2．2．3 培养基和相关溶液

2．2．4 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 产脂肪酶菌株的筛选

2．3．2 脂肪酶的水解活力测定

2．3．3 脂肪酶的水解位置专一性测定

2．3．4 山茶油的脂肪酸组成和位置分布测定

2．3．5 高产脂肪酶菌种的鉴定及系统发育分析的方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 产脂肪酶菌株的初筛

2．4．2 产脂肪酶菌株的复筛

2．4．3 高产脂肪酶菌种的鉴定及系统发育分析

2．5 本章小结

第三章 Trichosporon sp．F1-2脂肪酶的纯化和性质研究

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 主要试剂

3．2．2 培养基

3．2．3 柱层析材料

3．2．4 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 种子液培养

3．3．2 生物量测定

3．3．3 胞内外产酶曲线测定

3．3．4 粗酶液的制备

3．3．5 硫酸铵沉淀结合透析法纯化

3．3．6 DEAE-sepharose FF弱阴离子交换层析纯化

3．3．7 蛋白浓度测定

3．3．8 SDS-PAGE和银染

3．3．9 Trichosporon sp．F1-2脂肪酶主要性质研究

3．4 结果与讨论

3．4．1 生长曲线

3．4．2 脂肪酶的位置和产酶曲线

3．4．3 脂肪酶的纯化

3．4．4 性质研究

3．5 本章小结

第四章 葡萄糖和诱导油对Trichosporon sp．F1-2产酶和积累油脂的影响

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 主要试剂

4．2．2 培养基

4．2．3 仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 发酵生产

4．3．2 生物量测定

4．3．3 胞内外酶活测定

4．3．4 葡萄糖浓度测定

4．3．5 激光共聚焦显微镜观察脂质体和油滴

4．3．6 荧光分光光度计测定油滴

4．3．7 胞内油脂提取

4．3．8 脂肪酸组成测定

4．3．9 统计分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 T．sp．F1-2发酵时适宜的葡萄糖初始浓度

4．4．2 添加诱导油发酵

4．4．3 无诱导油发酵

4．4．4 两种途经下产脂肪酶效率对比

4．5 本章小结

第五章 Trichosporon sp．F1-2的常压室温等离子体诱变及高通量筛选

5．1 引言

5．2 材料与仪器

5．2．1 主要试剂

5．2．2 培养基

5．2．3 仪器与设备

5．3 实验方法

5．3．1 ARTP诱变

5．3．2 高通量筛选方法

5．3．3 遗传稳定性实验

5．3．4 发酵特性对比研究

5．3．5 数据处理

5．4 结果与讨论

5．4．1 ARTP诱变的致死率曲线

5．4．2 突变菌株的高通量筛选

5．4．3 突变株的遗传稳定性

5．4．4 野生菌及突变株的发酵特性

5．5 本章小结

第六章 利用月桂酸和山茶油的酸解反应分析脂肪酶的位置专一性

6．1 引言

6．2 材料与仪器

6．2．1 脂肪酶

6．2．2 主要试剂

6．2．3 仪器与设备

6．3 实验方法

6．3．1 分析无水体系中位置专一性和酶活力

6．3．2 分析水体系中位置专一性

6．3．3 统计分析

6．4 结果与讨论

6．4．1 操作可行性

6．4．2 线性

6．4．3 适用性和预测性

6．4．4 水解反应和合成反应中位置专一性的对比分析

6．5 本章小结

第七章 脂肪酶催化酯交换反应中的酰基迁移影响因素

7．1 引言

7．2 材料与仪器

7．2．1 脂肪酶

7．2．2 主要试剂

7．2．3 仪器与设备

7．3 实验方法

7．3．1 脂肪酶固定化

7．3．2 平衡水分活度

7．3．3 脂肪酶催化的酯交换反应

7．3．4 HPLC分析甘油三酯

7．3．5 GC分析脂肪酸

7．4 结果与讨论

7．4．1 底物的脂肪酸组成和位置分布

7．4．2 固定化脂肪酶的分析

7．4．3 脂肪酶和固定化材料对酯交换模型反应的影响

7．4．4 水分活度对酯交换模型反应的影响

7．5 本章小结

第八章 总结与展望

8．1 主要研究结果

8．2 创新点

8．3 研究展望

参考文献

附录

作者简介

致谢