鸦胆子提取物抗鸡球虫病效果评价及作用机制研究

摘要

鸡球虫病是鸡常见的寄生虫病，危害严重，每年对养禽业造成巨大的经济损失。目前该病防治工作的开展主要依靠药物，但是随着虫株耐药性的产生，部分抗球虫药物的效果大大降低甚至完全失效，因此发现新的药物刻不容缓。药用植物鸦胆子具有抗癌、抗阿米巴原虫、抗巴贝斯虫和抗疟疾等多种功效，但其抗球虫活性仍有待研究。本研究通过人工感染鸡球虫病模型评价鸦胆子提取物的体内治疗效果，利用荧光定量PCR技术在体外检测鸦胆子提取物对球虫增殖的影响，并运用电子显微镜观察鸦胆子处理对卵囊或子孢子形态及超微结构的改变，初步探索鸦胆子提取物的抗球虫作用机制。
　　一、鸦胆子提取物制备及化学成分鉴定
　　为制备实验所需的鸦胆子提取物，本试验运用薄层色谱法对药用植物进行理化鉴定，通过乙醇回流法结合萃取方法制备鸦胆子提取物，并采用气象色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其中的提取物鸦胆子油进行了化学成分分析。形态学观察及理化鉴定结果表明，实验材料为苦木科植物Bruceajavanica(L.)Merr.成熟干燥的果实。实验制备了三种鸦胆子提取物，分别为石油醚提取物（Brucea javanica petroleum ether extract，BJ-PE）、乙醇提取物(Brucea javanica ethonal extract，BJ-EE)和水提物（Brucea javanica water extract，BJ-WE），GC-MS分析结果表明鸦胆子油（即石油醚提取物）主要包含油酸等长链的脂肪酸、脂肪醇类化合物以及少量芳香族挥发性成分。
　　二、鸦胆子醇提物对鸡球虫病的治疗作用研究
　　为明确鸦胆子提取物对鸡球虫病的治疗作用，实验一将鸡分为5组:鸦胆子醇提物实验组（2.5g及5g生药每千克饲料）、常山酮阳性对照组、感染不给药组和不感染不给药组，每组10只鸡，攻虫后检测鸡便血、粪便卵囊数量和组织病变程度。结果表明，与对照组相比，实验组鸡只的血便排出量和病变计分显著降低（P＜0.05），但体重变化不显著，且抗球虫指数最高仅为131，显示轻度抗球虫效果。基于上述结果设计实验二，增设较高剂量的鸦胆子醇提物组(10g生药每千克饲料)，每组10只鸡，检测指标同上。结果显示增设的高剂量给药组抗球虫指数最高可达146，具有中等强度的抗球虫效果。在实验二的基础上，将实验三每组鸡数量扩大至20只，检测相关指标。结果进一步显示，鸦胆子醇提物能有效减少鸡血便的产生，降低卵囊排出量和盲肠中第二代裂殖体的数量，减轻盲肠病变程度，且对病鸡体重增重无显著影响;低、中、高剂量下抗球虫指数分别为154、161和155，达到了中等或良好的抗球虫效果。综上，本试验表明鸦胆子醇提物具有显著的抗鸡球虫作用，可作为抗鸡球虫病的候选药物作进一步研究。
　　三、鸦胆子醇提物与鸦胆子素-D体外抗球虫活性研究
　　为研究鸦胆子醇提物(BJ-EE)和鸦胆子特征性化合物鸦胆子素-D(Bruceine-D)的体外抗球虫活性，本试验利用MDBK细胞系建立柔嫩艾美耳球虫的体外培养体系，采用MTT法测定BJ-EE和Bruceine-D对MDBK细胞的毒性，并基于上述试验结果明确了体外抗球虫实验采用的药物浓度分别为BJ-EE(2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml)、Bruceine-D(0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μg/ml),药物作用时间分别为24h、48h和65h。实验结果显示，BJ-EE(2μg/ml)和Bruceine-D(0.8μg/ml)作用于细胞65h时，细胞存活率在90％以上;与对照组相比，BJ-EE实验组中球虫DNA增殖量显著降低，Bruceine-D除48h、0.05μg/ml实验组均表现出了显著差异，即具有抑制球虫增殖的作用;且球虫DNA增殖量在48h和65h时呈现药物剂量依赖性，即药物浓度越高则球虫的增殖量越低。综上所述，BJ-EE和Bruceine-D在体外具有良好的抗球虫活性。
　　四、鸦胆子提取物抗鸡球虫病作用机制初步探索
　　为明确鸦胆子提取物治疗鸡球虫病的作用机制，本研究使用不同浓度的石油醚提取物(BJ-PE)、乙醇提取物(BJ-EE)、水提物(B J-WE)和Bruceine-D孵育处理未孢子化卵囊，并利用光学显微镜和透射电镜观察作用后球虫子孢子形态和超微结构的改变。观察可见乙醇提取物、水提取物和Bruceine-D均表现出抑制卵囊孢子化的作用;乙醇提取物和Bruceine-D处理后的子孢子呈现皱缩、变圆、变短、细胞轮廓模糊、细胞膜破裂的现象，且胞内细胞器排列混乱，细胞结构扭曲，呈现病态的哑铃型。该结果表明鸦胆子对球虫卵囊孢子化具有轻微抑制作用，并在子孢子阶段具有比较显著的杀伤作用。因此，鸦胆子提取物抗球虫作用可能集中于子孢子阶段。
　　综上所述，本实验制备了鸦胆子石油醚提取物（油）、乙醇提取物和水提物，其中鸦胆子油主要含有油酸等脂肪酸类或脂肪醇类化合物;鸦胆子提取物具有抗鸡球虫病的作用，抗球虫效果可达中等或良好;鸦胆子醇提物和Bruceine-D对体外培养球虫的DNA增殖有抑制作用;提取物对球虫子孢子阶段具有明显杀伤作用，但具体作用机理还需深入研究。该研究为抗球虫药物的研发提供了新的方向。

目录

声明

论文说明

摘要

1．1 鸡球虫与球虫病

1．1．1 鸡球虫分类地位

1．1．2 鸡球虫生活史

第一章 鸡球虫与球虫病的防治研究进展

1．1．3 柔嫩艾美耳球虫的超微结构

1．2 鸡球虫病的防治

1．2．1 良好的家禽养殖管理

1．2．2 疫苗

1．2．3 抗球虫药物及作用机制

1．3 抗球虫天然药物研究进展

1．3．1 药物筛选模型

1．3．2 从天然药物中寻求新型抗球虫药物

1．4 药用植物鸦胆子研究进展

1．4．1 鸦胆子资源分布

1．4．2 鸦胆子化学成分

1．4．3 鸦胆子药理作用研究进展

1．5 本研究的目，的和意义

第二章 鸦胆子提取物制备及化学成分鉴定

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 鸦胆子的真伪鉴定

2．2．2 鸦胆子提取物的制备方法

2．2．3 鸦胆子油的GC-MS分析

2．3 结果与分析

2．3．1 鸦胆子外观鉴别

2．3．2 鸦胆子提取物的制备

2．3．3 鸦胆子薄层色谱鉴别

2．3．4 鸦胆子油成分分析

2．4 讨论

第三章 鸦胆子醇提物对鸡球虫病的治疗作用研究

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 寄生虫虫株

3．1．3 实验药物

3．2 方法

3．2．1 鸦胆子醇提物抗鸡球虫病实验(一)

3．2．2 鸦胆子醇提物抗鸡球虫病实验(二)

3．2．3 鸦胆子醇提物抗鸡球虫病实验(三)

3．2．4 抗球虫病药效评价标准

3．2．5 盲肠组织切片的制备

3．2．6 统计学分析

3．3 结果与分析

3．3．1 低剂量鸦胆子醇提物抗鸡球虫病作用初探(实验一)

3．3．2 较高剂量鸦胆子醇提物抗鸡球虫病作用(实验二)

3．3．3 鸦胆子醇提物抗鸡球虫病作用(实验三)

3．4 讨论

第四章 鸦胆子醇提物与鸦胆子素-D体外抗球虫活性研究

4．1 材料

4．1．3 实验动物

4．1．4 实验药物及主要试剂

4．2 方法

4．2．1 鸦胆子醇提物和鸦胆子素-D对MDBK细胞的毒性研究

4．2．2 球虫子孢子的纯化

4．2．3 球虫基因组DNA提取

4．2．4 球虫子孢子在MDBK细胞系的培养及给药

4．2．5 荧光定量PCR法测定药物对球虫子孢子增殖作用的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 荧光定量PCR引物确证

4．3．2 球虫子孢子的纯化

4．3．3 球虫体外培养体系的建立

4．3．4 鸦胆子醇提物和鸦胆子素-D对MDBK细胞的毒性研究

4．3．5 鸦胆子提取物对球虫子孢子的增殖具有抑制作用

4．4 讨论

第五章 鸦胆子提取物抗鸡球虫病作用机制初步探索

5．1 材料

5．1．1 主要材料、试剂与耗材

5．1．2 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 实验分组

5．2．2 子孢子的制备与药物处理

5．2．3 子孢子的透射电镜观察

5．3 结果与分析

5．3．1 药物对球虫卵囊孢子化的影响

5．3．2 子孢子药物处理后的光学显微镜观察

5．3．3 子孢子药物处理后的超微结构观察

5．4 讨论

全文小结

创新点

研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简介及在读期间取得的科研成果