巨噬细胞在肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生中的关键作用研究

摘要

免疫系统和炎症在肿瘤发生的每个阶段都有着很重要的作用。在已形成的肿瘤里，浸润的炎细胞通过与肿瘤细胞相互作用，改变肿瘤微环境从而影响肿瘤发展。肿瘤里的各种炎细胞及其与肿瘤细胞的相互作用是设计有效免疫治疗的理论基础。肝脏肿瘤在中国和世界范围内对健康都是一个巨大的威胁。然而由于肝癌遗传背景的复杂性至今还缺少准确模拟肝脏肿瘤的小鼠遗传学模型。人肝脏肿瘤的发生往往伴随着炎症反应，然而在炎性微环境里产生的肿瘤起始细胞是否主动改造免疫微环境尚不清楚。Hippo信号通路是近年来发现的调控器官大小的关键信号途径，它的异常与癌症发生特别是肝癌密切相关。为了在体内研究炎症细胞对肝脏肿瘤起始细胞的影响，特别是由Hippo通路失调引起的肝脏肿瘤，建立了一个流体动力学注射和转座子结合的小鼠肝癌模型。利用这种模型，在成体小鼠肝实质细胞内稳定过表达激活型的Hippo通路效应分子YAP，在4个月内就可以强烈诱导小鼠肝脏肿瘤生成。发现YAP的抑制蛋白VGLL4可以有效抑制YAP引起的肿瘤，而YAP的下游分子，miR-130a可以通过靶向VGLL4增强YAP诱导的肝脏肿癌形成。这一研究揭示了Hippo信号通路调控肿瘤发生的正反馈回路。意外地发现在YAP诱导肿瘤生成的早期，甚至是单个细胞的肿瘤起始细胞阶段就能很强地招募巨噬细胞。这些巨噬细胞具有肿瘤相关巨噬细胞的性质。敲除Hippo通路的激酶Mst1/2或Lats1/2从而激活内源性YAP也可以招募巨噬细胞。在肿瘤起始细胞里，YAP可以上调趋化因子Ccl2和Csf1的表达来招募巨噬细胞。YAP通过TEAD对Ccl2实现直接调控。通过敲减Ccl2和Csf1不仅有效阻止巨噬细胞的招募，还能导致肿瘤起始细胞被免疫清除。这种清除依赖于适应性免疫系统，并且通过p53依赖的途径。肿瘤起始细胞的清除最终导致了YAP不能诱导肿瘤生成。在人肝癌的癌前病变中和其他原癌基因活化型AKT和EGFR诱导形成的肿瘤起始细胞里，YAP的活化也伴随着巨噬细胞的招募。以上结果首先建立了一种快速、灵活，与人类疾病相关的肝癌小鼠模型，可广泛用于研究肝癌信号转导途径以及肝癌细胞与微环境的相互作用。更重要的是本研究揭示了Hippo通路在肝脏肿瘤形成过程中的一种新的非细胞自身作用的机制，即可以通过调控肿瘤微环境从而促进肿瘤发生。并且发现肿瘤起始细胞早在单个细胞阶段就可以通过主动招募巨噬细胞来塑造免疫抑制性微环境。这提示了一种新的免疫预防的方法，即通过抑制YAP活性或肿瘤起始细胞相关巨噬细胞达到清除肿瘤起始细胞预防肿瘤发生的效果。

目录

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致谢

摘要

缩略词清单

第1章 引言

1．1 Hippo通路在肝脏肿瘤形成中的作用

1．1．1 Hippo通路组成和功能

1．1．2 Hippo通路失活与肝脏肿瘤发生

1．1．3 Hippo通路控制肝细胞分化命运

1．2 流体动力学注射建立小鼠肝脏肿瘤模型

1．2．1 肝脏肿瘤研究现状

1．2．2 肝脏肿瘤研究的小鼠模型

1．3 免疫与肿瘤发生

1．3．1 炎症与肿瘤发生

1．3．2 免疫细胞和肿瘤发生

1．3．3 免疫监视和免疫编辑

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 小鼠

2．1．2 质粒

2．1．3 抗体

2．1．4 RT-qPCR引物序列

2．1．5 siRNA，shRNA与gRNA靶序列

2．1．6 CHIP引物序列

2．1．7 主要仪器

2．1．8 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 RNA的提取、逆转录与实时荧光定量PCR

2．2．3 肝脏、外周血、骨髓和脾脏中炎细胞的体内分离

2．2．4 免疫印迹

2．2．5 染色质免疫共沉淀实验(CHIP)

2．2．6 流体动力注射小鼠模型(HDI)

2．2．7 免疫组化

2．2．8 免疫荧光

2．2．9 荧光素酶报告基因实验

第3章 在小鼠肝实质细胞里嵌合稳定过表达YAP诱导肝脏肿瘤生成

3．1 HDI条件优化

3．2 活化型YAP在小鼠肝脏里以嵌合方式稳定表达可以诱导肝脏肿瘤生成

3．3 miR-130a可以通过靶向VGLL4蛋白促进YAP诱导的小鼠肝脏肿瘤生成

第4章 YAP诱导形成的肝脏肿瘤起始细胞招募巨噬细胞

4．1 过表达活化型YAP导致肿瘤起始细胞形成并能招募巨噬细胞

4．2 通过改变Hippo通路激活内源性YAP也可以招募巨噬细胞

4．3 YAP-5SA通过TEAD活性上调趋化因子Ccl2和Csf1

4．4 CCL2-CCR2在巨噬细胞的招募中有重要作用

第5章 巨噬细胞对YAP诱导肿瘤生成的影响

5．1 巨噬细胞可以影响肿瘤起始细胞的存活从而促进肿瘤发生

5．2 在其他原癌基因诱导的肿瘤起始细胞和人肝脏早期病变中YAP的活化也伴随巨噬细胞的招募

第6章 讨论

6．1 Hippo通路在发育和肿瘤发生中的细胞自身作用和非细胞自身作用

6．2 用HDI和转座子结合技术来研究小鼠肝脏肿瘤生成的优势

6．3 巨噬细胞在促进肿瘤发生中的新功能

6．4 展望

参考文献

作者简历及科研成果