不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂质代谢影响的研究

摘要

猪肉风味是猪肉品质的重要组成部分，日粮脂肪酸组成可以通过影响猪骨骼肌细胞膜和细胞内的脂肪酸组成以及肌肉内脂肪含量，影响猪肉风味。本文通过研究不同饱和度脂肪酸对骨骼肌细胞脂质沉积和代谢的影响，旨在为日粮脂肪酸改善猪肉品质提供理论依据。国内外研究发现不同碳链长度、饱和程度的脂肪酸有着不同的氧化速率。而且不同饱和程度的脂肪酸在不同组织和细胞中的代谢也存在差异。体外分离培养、诱导成肌分化的猪骨骼肌卫星细胞可作为研究猪骨骼肌代谢的体外模型。本研究利用杜长大三元杂交猪背最长肌分离细胞，构建猪骨骼肌卫星细胞体外培养模型，研究不同饱和度脂肪酸棕榈酸(Palmitic acid,PA)、油酸(Oleic acid，OA)、亚油酸(Llinoleic acid，LA)在猪骨骼肌细胞内的沉积和代谢差异，并对这些差异产生的原因进行了探讨。本研究发现不同饱和度脂肪酸在猪骨骼肌细胞沉积不同，继而利用同位素示踪法跟踪脂肪酸在猪骨骼肌细胞中的代谢过程，并通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法检测该细胞脂肪酸代谢途径中关键分子的基因和蛋白表达，初步揭示不同脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂质代谢的影响。通过对猪骨骼肌细胞脂质代谢相关基因蛋白分析及后续试验验证，发现多不饱和脂肪酸可能是通AMPK途径而非PPARγ影响猪骨骼肌细胞脂肪酸摄取和氧化。本研究建立了猪骨骼肌卫星细胞体外培养模型，探究了不同饱和度脂肪酸代谢差异及其机制，旨在为不同饱和度脂肪酸影响猪骨骼肌细胞脂质代谢提供理论基础，为猪肉品质改善和人类相关疾病提供借鉴。研究所取得的成果如下:
　　1.猪骨骼肌卫星细胞体外模型的建立
　　选择新生3日龄杜长大仔猪，取背最长肌分离得到猪骨骼肌卫星细胞，显微镜观察细胞呈长梭形。细胞长到80～90％融合时，采用2％马血清诱导细胞成肌分化，诱导3天后显微镜下细胞呈细长状平行排列，有融合趋势，诱导5天后大量细胞融合，初步判断为猪骨骼肌卫星细胞。通过q-PCR检测成肌分化过程中基因表达情况发现:分化初期生肌决定因子（Myogenic Differentiation Antigen，MyoD)有较高表达量，分化标志因子肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)在分化初期表达量急剧提高。提示:猪骨骼肌卫星细胞在成肌诱导1天后即开始分化，分化5天后开始大量融合，满足研究所需猪骨骼肌卫星细胞和猪骨骼肌细胞体外模型的需要，可进一步实验。
　　2.不同饱和度脂肪酸在猪骨骼肌细胞的代谢差异
　　100μM PA、OA、LA孵育猪骨骼肌细胞后，油红O和甘油三酯测定发现细胞内甘油三酯沉积显著增加(P＜0.05)，且多不饱和脂肪酸亚油酸处理组显著高于棕榈酸和油酸处理组(P＜0.05)。本试验利用同位素示踪法对脂肪酸处理后猪骨骼肌细胞脂质代谢每个过程进行相对定量，试验用[1-14C]100μM脂肪酸处理细胞24h后利用放射性衰变率分别对细胞脂肪酸摄取、脂肪酸氧化、细胞总脂质和细胞脂质分类进行相对定量，试验发现单不饱和脂肪酸OA和多不饱和脂肪酸LA处理组的脂肪酸摄取量显著高于饱和脂肪酸PA组（P＜0.05），LA组脂肪酸氧化量均最高(P＜0.05)，虽三个脂肪酸组处理后细胞总脂质含量无显著差异，但LA在甘油三酯中的沉积量最高，PA进入磷脂最多。以上结果提示:细胞外脂肪酸孵育可以影响猪骨骼肌细胞脂肪酸代谢，与饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸相比，多不饱和脂肪酸亚油酸可以显著促进脂肪酸摄取、氧化和甘油三酯沉积。
　　3.不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂质代谢关键基因蛋白的影响
　　骨骼肌细胞内脂肪酸不仅是细胞脂质代谢的原料和产物，还可作为某些转录因子或酶的配体与之结合从而影响包括脂质代谢在内的诸多细胞代谢过程。骨骼肌细胞的脂质代谢过程是由脂肪代谢过程的酶和因子决定的，通过了解这些关键过程中酶和因子基因表达的改变，初步探讨不同饱和度脂肪酸引起猪骨骼肌细胞脂质代谢差异产生的机制。研究发现与棕榈酸和油酸处理组相比，亚油酸能够显著提高骨骼肌细胞脂肪酸摄取相关基因CD36、FABP4、FATP1，脂肪酸氧化相关基因CPT1、COX、CytC的基因表达(P＜0.05)，以及线粒体功能相关蛋白NRF1的表达，并能够显著促进甘油三酯合成相关基因DGAT2、FAS的表达(P＜0.05)。
　　4.不同饱和度脂肪酸引起猪骨骼肌细胞脂质代谢差异的通路
　　本课题组前期研究发现棕榈酸、油酸、亚油酸能够通过影响PPARγ磷酸化从而引起猪脂肪细胞脂质沉积差异。相比于长白猪，金华猪骨骼肌细胞内有更多脂质沉积，研究发现其PPARγ磷酸化程度低于长白猪，说明PPARγ磷酸化可能在骨骼肌脂质代谢过程中也发挥重要作用。研究发现不同脂肪酸处理后，PPARγ磷酸化水平无显著差异。ERK是PPARγ112位磷酸化激酶，ERK抑制剂和脂肪酸共同处理细胞后，骨骼肌细胞的脂质沉积并无显著变化。研究证明与脂肪细胞不同，不同饱和程度的脂肪酸并非通过PPARγ112位磷酸化途径影响猪骨骼肌脂质代谢。诱导成肌分化过程中，AMPKα2基因的表达量随着骨骼肌成肌分化逐渐升高(P＜0.05)，提示其可能在成熟骨骼肌细胞中发挥重要作用。不同脂肪酸处理后发现LA处理组AMPK基因及pAMPK表达量提高(P＜0.05)。添加AMPK抑制剂compoundC时，不同脂肪酸在猪骨骼肌细胞内沉积量无显著差异，且不同脂肪酸处理间脂质代谢相关基因CD36、ACC、DGAT2的基因表达量无显著差异（P＞0.05）。说明LA可能通过AMPK途径促进猪骨骼肌细胞脂肪酸摄取和甘油三酯沉积。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

第一节 猪骨骼肌及脂肪酸组成对猪肉品质的影响

1．1 猪骨骼肌组织的概述

1．2 猪肉品质的形成

1．3 脂肪酸组成对猪肉品质的影响

第二节 骨骼肌的脂质代谢及不同脂肪酸代谢差异

2．1 骨骼肌脂质代谢

2．2 不同脂肪酸代谢差异

第三节 细胞内可受脂肪酸调控的代谢过程

3．1 影响甘油三酯合成

3．2 脂肪酸通过影响核转录因子影响细胞代谢

3．3 脂肪酸对AMPK的影响

第四节 本研究的目的和意义

4．1 研究目的和意义

4．2 研究内容

第二章 猪骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定

第一节 猪骨骼肌卫星细胞的分离与培养

1．2 试验的材料与仪器

1．3 猪骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第二节 猪骨骼肌卫星细胞的鉴定

2．2 试验材料与仪器

2．3 猪骨骼肌卫星细胞鉴定相关实验方法

2．4 结果与分析

2．5 讨论

第三章 不同饱和度脂肪酸在猪骨骼肌细胞代谢差异

第一节 脂肪酸孵育后猪骨骼肌细胞甘油三酯沉积

1．2 试验材料与仪器

1．3 试验方法

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第二节 同位素示踪法跟踪不同饱和度脂肪酸在猪骨骼肌细胞中的代谢

2．2 试验材料与仪器

2．3 试验方法

2．4 结果与分析

2．5 讨论

第四章 不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂质代谢影响

第一节 不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂肪酸摄取的影响

1．2 试验材料与仪器

1．3 试验方法

1．4 结果与分析

1．5 讨论

第二节 不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞脂肪酸氧化的影响

2．1 引言

2．2 试验材料与仪器

2．3 试验方法

2．4 结果与分析

2．5 讨论

第三节 不同饱和度脂肪酸对猪骨骼肌细胞甘油三酯代谢的影响

3．1 引言

3．2 试验材料与仪器

3．3 试验方法

3．4 结果与分析

3．5 讨论

第四节 脂肪酸通过PPARγ途径影响脂质代谢

4．2 试验材料与仪器

4．3 试验方法

4．4 结果与分析

4．5 讨论

第五节 脂肪酸的AMPK通路影响细胞脂质代谢

5．3 试验方法

5．4 结果与分析

5．5 讨论

小结、创新点与研究展望

参考文献

作者简历及取得的科研成果