扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的构建及其在定向进化中的应用

摘要

光学纯(R）-邻氯扁桃酸甲酯和(R)-乙酰基邻氯扁桃酸是心血管药物(S)-氯吡格雷工业化生产过程中两种重要的手性中间体。利用酯酶和扁桃酸消旋酶进行动态动力学拆分制备这两种化合物的理论收率可达100％，能够有效解决传统化学拆分过程中反应条件苛刻、对环境造成污染等问题，契合绿色化学的理念。然而，天然扁桃酸消旋酶对拆分过程中的副产物(S)-邻氯扁桃酸的催化活性非常低，在很大程度上限制了该动态动力学拆分过程的进行。为此，本课题构建了一种适用于扁桃酸消旋酶突变体库筛选的高通量筛选方法，并在此基础上利用定向进化的方法提高了扁桃酸消旋酶对(S)-邻氯扁桃酸的催化活力。
　　为了辅助扁桃酸消旋酶的定向进化，本研究构建了一种选择性氧化系统用于扁桃酸消旋酶突变体库的筛选。该方法利用一种具有绝对R构型对映体选择性的D-扁桃酸脱氢酶将外消旋反应中产生的(R）-对映体转化成酮酸类化合物，进而用于后续的显色反应。最终成功为扁桃酸消旋酶构建了双酶联动的高通量筛选方法，并且通过手性高效液相色谱验证了该方法的有效性。
　　基于这种高通量筛选方法，对恶臭假单胞菌来源的扁桃酸消旋酶进行了定向进化，最终获得了一株三点突变体V22I/V29I/Y54F(MRDE1)，其酶活比天然酶提高了3倍左右。同时，为了在反应动力学的角度解释酶活提高的可能来源，考察了扁桃酸消旋酶及其突变体对两种构型底物的酶促反应动力学，结果发现突变位点之间存在着一定的协同效应，并且突变体催化效率的改善主要来源于其kcat值的提高。
　　最后，通过分子对接和分子动力学模拟对突变体酶活提高的来源进一步进行了解释。结果表明，酶与底物分子间质子传递作用的增强和π-π相互作用的引入在突变体酶活提高中起着关键作用。另外，通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积对酶-底物结合自由能进行了分析，发现静电作用是造成突变体结合自由能降低的主要原因，说明静电力在活性中心相互作用网中起着重要作用。
　　研究结果表明，利用定向进化对酶进行改造以提高其催化性能是一种可行、有效的手段，但前提是需要一个合适的、有效的高通量筛选方法。此外，本研究中构建的高通量筛选方法与扁桃酸消旋酶的成功改造对其他消旋酶的分子改造具有一定的参考价值，同时为通过定向进化提高消旋酶对非天然底物的催化性能提供了借鉴。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 手性化合物及其单体制备方法

1．1．1 手性化合物

1．1．2 手性单体的制备方法

1．1．3 手性化合物的的动态动力学拆分

1．1．4 (R)-邻氯扁桃酸衍生物及其动态动力学拆分

1．2 扁桃酸消旋酶概述

1．2．1 扁桃酸消旋酶简介

1．2．2 扁桃酸消旋酶的研究现状

1．3 酶分子的改造

1．3．1 理性设计

1．3．2 定向进化

1．3．3 半理性设计

1．4 分子模拟

1．4．1 量子力学模拟

1．4．2 分子力学模拟

1．4．3 分子动力学模拟

1．4．4 蒙特卡洛法

1．4．5 分子对接

1．5 课题研究的内容、目的及意义

2 扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的建立与验证

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 D-MDH专一性的验证

2．3．2 底物浓度对HTS的影响

2．3．3 D-MDH浓度对HTS的影响

2．3．4 反应时间对HTS的影响

2．3．5 HTS方法的建立与验证

2．3．6 DNPH及其衍生物的全波长扫描

2．3．7 MR酶活与吸光值之间的关系

2．4 小结

3 扁桃酸消旋酶的定向进化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 MR基因的扩增

3．3．2 重组子的菌落PCR验证

3．3．3 易错PCR体系条件的确定

3．3．4 进化结果与突变体的酶活检测

3．4 小结

4 扁桃酸消旋酶及其突变体的酶促反应动力学分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 MR及其突变体的SDS-PAGE电泳分析

4．3．2 蛋白浓度的标准曲线

4．3．3 邻氯扁桃酸浓度-旋光值的标准曲线

4．3．4 最适反应温度

4．3．5 最适反应pH

4．3．6 MR及其突变体的动力学分析

4．4 小结

5 扁桃酸消旋酶的分子模拟

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 野生型扁桃酸消旋酶及其突变体的圆二色谱分析

5．3．2 扁桃酸消旋酶与(S)-邻氯扁桃酸的分子对接分析

5．3．3 分子动力学模拟分析

5．3．4 模拟体系平衡情况的分析

5．3．5 模拟体系结合自由能及关键氨基酸贡献值的分析

5．4 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

作者简历