AMOT家族蛋白在Hippo信号通路中的功能和分子机制研究

摘要

相对稳定的器官大小是多细胞生物的一个基本特征。近年的研究发现Hippo信号通路是控制器官大小的一条关键通路。Hippo通路通过由mammalian STE20-likekinases1/2(MST1/2)-salvador1(SAV1)复合物与large tumor suppressor kinase1/2(LATS1/2)-MOB kinase activator1A/B(MOB1 A/B)复合物组成的核心蛋白激酶链磷酸化下游转录辅激活因子Yes-associated protein(YAP)/transcriptional coactivatorwith a PDZ-binding domain(TAZ)，并促进YAP/TAZ胞质滞留和降解来发挥功能。但是对于Hippo信号通路下游是否有不依赖于YAP/TAZ的功能却知之甚少。我们通过筛选发现angiomotin(AMOT)家族蛋白是Hippo通路LATS1/2激酶的新底物。LATS1/2响应上游Gprotein coupled receptor(GPCR)等信号的调控，磷酸化AMOT蛋白的剪切体之一AMOTp130的HXRXXS保守基序。磷酸化抑制AMOTp130与微丝之间的结合，并抑制微丝与黏着斑的形成。我们还发现LATS1/2对AMOTp130的磷酸化在体外抑制血管内皮细胞的迁移，在体内抑制斑马鱼胚胎血管形成。这些结果表明AMOTp130是LATS1/2的直接底物，并且介导Hippo信号通路在内皮细胞迁移和血管生成中的重要功能。
　　另一方面，AMOT家族蛋白作为Hippo通路的成员在调控Hippo通路活性方面发挥重要作用。YAP作为Hippo信号通路中最重要的效应蛋白可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。但YAP的活性失调会导致肿瘤的形成，所以YAP激活的强度及持续时间都需要受到精确的调控。我们发现AMOT家族蛋白angiomotin-like2(AMOTL2)和LATS2在YAP激活导致的负反馈调控中具有重要功能。YAP激活后强烈激活上游抑制激酶LATS1/2的活性。这主要是通过YAP直接结合到LATS2和AMOTL2基因的启动子，促进LATS2和AMOTL2的转录，并且通过间接的方式提高neurofibromin2(NF2)蛋白的表达量来实现的。YAP激活导致的负反馈调控在血清刺激、失去细胞间接触抑制等条件下都存在，并且YAP在诱导肿瘤形成过程中也启动负反馈调控。YAP通过激活负反馈机制来精确调节自身的活性，这对机体稳态维持和其失调导致疾病发生非常关键。
　　以上研究表明AMOT家族蛋白在多个层面参与Hippo信号通路。一方面AMOTp130作为Hippo通路LATS1/2激酶的新底物，介导Hippo通路在调节血管生成方面的功能;另一方面AMOTL2作为YAP的靶基因，通过负反馈来抑制YAP的活性，维持Hippo通路在体内的稳态。本课题首次报道了Hippo通路在生理条件下对血管生成的调控，并发现了维持Hippo通路稳态的机制。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 Hippo信号通路

1．1．1 果蝇的Hippo信号通路

1．1．2 哺乳动物的Hippo信号通路

1．2 LATS1／2激酶

1．2．2 LATS1／2激酶的底物与功能

1．3 AMOT家族蛋白

1．3．1 AMOT家族蛋白的序列结构

1．3．2 AMOT家族蛋白的调控

1．3．3 AMOT家族蛋白在Hippo信号通路中的功能

1．3．4 AMOT家族蛋白在内皮细胞及血管生成中的作用

2．1．2 小鼠

2．1．3 质粒

2．1．4 抗体

2．1．5 siRNA及AMOT-MO序列

2．1．6 ChIP引物

2．1．7 主要试剂耗材

2．1．8 主要仪器

2．1．9 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 PCR扩增目的基因

2．2．3 大肠杆菌转化

2．2．4 质粒构建

2．2．5 点突变构建

2．2．6 细胞转染

2．2．7 病毒包装侵染

2．2．8 免疫印迹

2．2．9 免疫荧光

2．2．10 免疫沉淀

2．2．11 GST蛋白纯化

2．2．12 体外激酶实验

2．2．13 RNA提取

2．2．14 RNA逆转录

2．2．15 荧光定量PCR

2．2．16 染色质免疫沉淀

2．2．17 肌动蛋白结合蛋白沉降实验(Cytoskeleton：BK013)

2．2．18 流体动力学注射小鼠模型

2．2．19 斑马鱼血管形成实验

2．2．20 细胞迁移实验

第三章 LATS1／2激酶磷酸化AMOT抑制细胞迁移和血管生成

3．1．1 LATS1／2诱导AMOT家族蛋白磷酸化

3．1．2 Hippo信号通路调控AMOTp130磷酸化

3．2．2 LATS1／2直接磷酸化AMOTp130第175位丝氨酸

3．3 GPCR信号调控AMOTp130磷酸化

3．4 AMOTp130的S175磷酸化抑制AMOT与微丝的结合

3．4．1 AMOTp130的S175磷酸化抑制AMOT与应力纤维的共定位

3．4．2 LATS1／2抑制内源AMOT与应力纤维的共定位

3．4．3 AMOTp130的S175磷酸化抑制AMOTp130与微丝的直接结合

3．4．4 AMOTp130的S175磷酸化不影响与YAP的结合

3．5．1 AMOTp130磷酸化干扰应力纤维和黏着斑的形成

3．5．2 AMOTp130磷酸化抑制内皮细胞迁移

3．6 Hippo通路通过磷酸化AMOT调控应力纤维、黏着斑的形成和细胞迁移

3．7 AMOTp130的磷酸化在体内抑制斑马鱼的血管生成

3．7．1 AMOT在斑马鱼血管生成中具有重要功能

3．7．2 AMOTp130的磷酸化在体内抑制斑马鱼的血管生成

3．8 小结

3．8．1 AMOT家族蛋白是LATS1／2新的底物

3．8．2 AMOT家族蛋白多层次参与Hippo通路

3．8．3 AMOT与YAP／TAZ协同发挥功能

3．8．4 Hippo信号通路通过磷酸化AMOTp130调控血管生成

第四章 YAP激活诱导的负反馈通路

4．1．1 YAP的激活诱导Hippo通路反馈性活化

4．1．2 YAP通过其转录活性激活LATS1／2

4．2 YAP直接调控LATS2和AMOTL2的转录

4．2．1 YAP直接调控LATS2的转录

4．2．2 YAP直接调控AMOTL2的转录

4．3 YAP诱导的负反馈调控受到细胞间连接和GPCR信号调控

4．3．1 YAP诱导的负反馈受到细胞间连接的调控

4．3．2 YAP诱导的负反馈受到GPCR信号的调控

4．4 YAP诱导肿瘤发生过程中激活负反馈机制

4．4．1 YAP过表达诱导肿瘤发生过程中激活负反馈机制

4．4．2 MST1／2敲除激活负反馈机制

4．5 本章小结

4．5．1 Hippo通路在哺乳动物细胞内的负反馈机制

4．5．2 生理病理条件下Hippo通路的负反馈机制

4．5．3 AMOTL2在Hippo通路的负反馈机制中发挥重要作用

第五章 总结

5．1 AMOT家族蛋白受到Hippo信号通路的调控

5．2 AMOTL2参与Hippo通路的负反馈调控

5．3 展望

参考文献

作者简历和科研成果