应用病人来源iPSC诱导的神经元细胞对神经变性疾病中线粒体变化机制的研究

摘要

背景:
　　遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia，HSP）是在1883年由Strümpell作为一种带有遗传特征的痉挛性截瘫疾病进行首次报道，随后Lorrain对HSP展开了更加详细的分析讨论，因此HSP也称之为家族性痉挛性截瘫或Strümpell-Lorrain综合征。统计研究表明HSP的发病率约为2-10/100000。临床上症状表现多样化，不同病人不同表现，通常还伴有脑瘫，视神经损伤，智力障碍等一些神经系统症状。大多具有的共同特征包括出现下肢萎缩和痉挛性等临床表现，多数学者将其归于遗传性共济失调范畴，约占后者发病总数的1/4。遗传性痉挛性截瘫也是一种遗传上高度异质性的神经系统遗传病，目前已经有76个HSP致病基因位点被定位，确定的HSP致病基因也已达54个。其中最为常见的是Spastin基因突变所致的遗传性痉挛性截瘫4型（spastic paraplegia-4，SPG4），约占常染色体显性遗传的40％。近年来，不断地有一些遗传研究报道新的致病基因突变，其中Tamar Harel.et al报道了一个多发性的线粒体内膜蛋白ATAD3A(ATPase family AAA-domain containing protein3A)上的突变c.1582C＞T(p.Arg528Trp)。结果显示该位点可以导致神经性疾病综合征，症状包括发育迟缓，肌肉张力低下，痉挛，视神经萎缩，轴突神经病以及肥厚型心肌病等。通过全外显子测序，我们对一个HSP患病家系所有的候选致病突变进行检测，发现该家系的两个患者均携带有ATAD3A显性遗传杂合突变c.1064 G＞A(p.G355D)，其中35岁的母系患者表现为伴随轴突神经病的HSP症状，3.5岁的子系患者表现为运动障碍的脑瘫，并且其发病均始于儿童时期。显性遗传突变ATAD3A c.1064G＞A(p.G355D)位于负责ATP结合的Walker A结构域。目前，关于线粒体内膜AAA(ATPase associated with diverse cellular activities)蛋白ATAD3A的功能尚不明确，已知AAA蛋白是通过形成六聚体环状结构发生作用，ATP酶的催化作用需要底物的配合。而后，体外重组蛋白实验也证明了这个突变蛋白的ATP酶活性较野生型表现出显著的降低。为进一步研究ATAD3A c.1064G＞A(p.G355D)突变的功能特性，我们分别构建了野生型ATAD3A和突变型质粒，在过表达细胞模型中观察到过度分裂的线粒体形态以及溶酶体的聚集。同样，我们对病人来源的成纤维细胞模型以及多功能干细胞诱导的神经元进行研究分析，也观察到紊乱的线粒体动态平衡以及异常的更多溶酶体。在成纤维细胞模型中发现病人细胞处于一种通过抑制mTOR激活造成的类似饥饿状态，并证明上述这些变化与自噬的上调相关。综上所述，我们得出ATAD3A基因突变可以导致高度异质性的包括HSP在内的一系列显性遗传神经系统疾病，并且拓展了线粒体内膜蛋白ATAD3A与痉挛疾病之间的潜在关系。
　　目的:
　　1.收集目标HSP病人临床症状，通过全外显子测序找到潜在的致病基因突变。
　　2.在构建的ATAD3A过表达细胞模型中观察突变体的异常表型。
　　3.在病人特异来源的成纤维细胞模型中观察病人细胞与正常细胞的差异。
　　4.由成纤维细胞诱导的病人特异来源多功能干细胞分化的神经元细胞模型中观察病人细胞相对于正常细胞的异常表型。
　　方法:
　　1.应用临床观察和核磁共振技术对目标HSP病人进行临床症状的诊断和判定。
　　2.取病人静脉血液，提取病人全DNA序列，Illumina HiSeq2500 sequencing进行全外显子测序，利用ANNOVAR程序对测序结果进行分析和筛选，找到潜在致病基因突变。
　　3.生物信息学方法用软件Discovery studio4.5 software(BIOVIA)对野生型和突变体ATAD3A蛋白结构进行了预测，为进一步的功能研究分析提供线索依据。
　　4.通过体外重组和纯化得到野生型和突变体的ATAD3A蛋白，对其进行ATP酶活性检测（通过测量磷酸盐的释放量来计算ATP酶活性）。
　　5.在体外构建过表达野生型和突变体的ATAD3A质粒，并在正常人的成纤维细胞系统中进行过表达试验，通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测，通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。
　　6.利用病人皮肤组织原代培养特异性的成纤维细胞，通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测，通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。
　　7.体外利用病人成纤维细胞构建特异多功能干细胞系，通过逆转录病毒将三种附加体质粒包括六种重要因子(OCT3/4，SOX2，KLF4，L-MYC，LIN28和T53shRNA)整合到细胞进行重编程。
　　8.通过在不同阶段提供营养因子的方法将多功能干细胞特异诱导分化为神经元。
　　9.在病人特异性的神经元中通过蛋白免疫印迹反应进行蛋白检测，通过活体的线粒体和溶酶体追踪以及免疫荧光进行线粒体标记染色形态功能分析。
　　结果:
　　1.临床观察目标病人出现明显的下肢萎缩畸形症状，且核磁共振显示脊髓有萎缩变性的形态特征。ATAD3A序列进化上高度保守，且我们研究的目的片段在不同的生物种属和同一蛋白家族之间也都高度保守。
　　2.全外显子测序对潜在的致病基因突变进行筛查，虽然在已知的HSP致病基因中未发现突变，但是发现家系图谱显示第二代母亲患者与第三代孩子患者均携带有ATAD3Ac.1064G＞A(p.G355D)突变。
　　3.野生型和突变体ATAD3A蛋白结构预测结果显示了目标突变在距离底物结合部位的γ-磷酸盐小于4(A)的位置能够引入一个正在进入的ATP磷酸负电荷，这一结果将很可能导致其对ATP的亲和力下降。
　　4.体外重组和纯化AT AD3A野生型和突变体目的蛋白，其ATP酶活性实验结果显示Walker A突变蛋白较野生型有显著的下降趋势。并且野生型与突变体的混合蛋白表现出同样程度的ATP酶活性下降，这一结果表现其负显性调控特性。
　　5.正常人成纤维细胞中过表达野生型ATAD3A，以及K358R和G355D的突变体，同时共转染线粒体标记的绿色荧光蛋白(mitoGFP)，蛋白免疫印迹反应结果证实了过表达系统的有效性，进而对线粒体过度分裂的细胞在转染细胞的百分比进行计数，结果显示过表达突变体组相比于过表达野生型ATAD3A组存在更多的线粒体过度分裂细胞。
　　6.在病人皮肤组织原代培养出的成纤维细胞模型中发现尽管ATAD3A蛋白的表达量与正常人无差异，但是在呼吸链复合物亚基Ⅱ和Ⅳ的表达水平较正常组明显升高，而Drp1的表达明显降低，且观察到病人细胞中伴有超极化线粒体。
　　7.对活细胞进行线粒体(Mito-tracker Red)和溶酶体(Lyso-tracker Green)的追踪以及电镜结果显示其形态学变化，发现在病人成纤维细胞中有异常的延长线粒体形态以及更多的溶酶体空洞。
　　8.验证诱导多功能干细胞系，RT-PCR以及免疫荧光染色结果显示iPSC细胞系中均能够内源表达OCT4，SSEA4和TRA-1-60等于细胞表面标记物，且RT-PCR证实了OriP和EBNA1在干细胞系中不见表达，表明转基因载体已被清除。
　　9.在活细胞中进行线粒体(Mito-tracker Red)和溶酶体(Lyso-tracker Green)追踪以及电镜结果显示形态学变化，发现在病人特异性的神经元细胞中有类似成纤维细胞模型出现的异常线粒体过度分裂形态以及更多的溶酶体空洞。
　　结论:
　　1.ATAD3A重组的突变体蛋白有表现出显著的ATP酶活性下降趋势。
　　2.过表达细胞模型中，突变体ATAD3A过表达表现出明显的线粒体形态异常过度分裂，且伴随有溶酶体堆积及自噬水平的上调。
　　3.同样类似的在病人来源的成纤维细胞和多功能干细胞特异诱导神经元的细胞模型中，观察到紊乱的线粒体动态平衡和更多的溶酶体空洞。
　　4.病人细胞处于一种类似饥饿的状态，存在自噬活动增强。ATAD3A显性负突变进而能导致高度异质性的包括HSP在内的一系列多变化的显性遗传神经系统疾病，并且家系不同成员中可存在显著差异。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一部分 家系特征，突变鉴定以及致病突变c．1064G>A(p．G355D)导致的ATP酶活性变化

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 本章小结

第二部分 过表达质粒构建以及过表达突变型质粒对线粒体形态的影响

1 引言

2 材料和方法

3．实验结果

4 讨论

5 本章小结

第三部分 病人特异性成纤维细胞模型中线粒体异常及自噬调节

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 本章小结

第四部分 病人特异性多功能于细胞诱导神经元细胞模型中线粒体异常及分子蛋白表达

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 本章小结

全文讨论与总结

参考文献

综述 诱导多功能干细胞在神经系统疾病研究进展及其细胞移植应用前景

作者简历及在学期间所取得的科研成果