褐飞虱去饱和酶Nldesat10及唾液分泌蛋白NlSEF1的生物学功能剖析

摘要

褐飞虱Nilaparvata lugens(St(a)l)(Hemiptera: Delphacidae)是最重要的水稻害虫之一，褐飞虱为害降低水稻光合作用率、茎叶氮浓度、叶绿素含量和有机物干重，强烈影响水稻产量。
　　目前已有诸多关于昆虫去饱和酶(desaturase，desat)在信息素生物合成中发挥功能的报道，但对于去饱和酶在昆虫生长发育繁殖以及在与植物互作关系中的作用还研究得较少。在本文中，我们鉴定、注释了褐飞虱去饱和酶基因，并通过序列联配、系统进化分析、表达谱分析及RNA干扰等，探索了褐飞虱去饱和酶家族，尤其是对褐飞虱存活及卵巢发育具有明显影响的Nldesat10在褐飞虱生长发育繁殖及其与水稻互作中的作用。此外，本文还对一个唾液分泌蛋白NlSEF1(salivary EF-hand protein)在调控水稻防御反应中的作用开展了研究。主要研究结果如下:
　　(1)去饱和酶Nldesat10影响褐飞虱的生长发育繁殖及其与水稻的互作关系
　　基于生物信息学搜索从褐飞虱基因组鉴定出10条去饱和酶基因，其中2条基因分别编码细胞色素b5融合去饱和酶（cytochrome b5 fused desaturase）和Δ4-鞘脂类去饱和酶(Δ4-sphingolipid-desaturase)，其他8条为Δ9-去饱和酶。表达模式分析表明，Nldesat1主要在头部和表皮中表达，Nldesat2、Nldesat3和Nldesat8在表皮中转录水平最高，Nldesat4、Nldesat5和Nldesat6在各组织间表达量较稳定，Nldesat7和Nldesat9主要在脂肪体、表皮和头部中转录水平较高，而Nldesat10主要在卵巢和表皮中表达;各去饱和酶基因的转录水平都随不同发育阶段而发生变化，并且都有各自的特异性;总体而言，Nldesat1-Nldesat6在发育阶段的转录水平相对比较稳定，Nldesat7和Nldesat9在卵中转录水平较低，Nldesat8在卵和雌成虫中较低，而Nldesat10则在整个若虫期的转录水平都比较低。除Nldesat3、Nldesat5和Nldesat8之外，其他7个基因在注射双链RNA7天后，均导致褐飞虱的存活率显著低于对照。
　　沉默Nldesat10的褐飞虱死亡率最高，并导致雌成虫蛋白质和甘油三酯含量降低、腹部萎缩、卵巢不发育以及取食量、体重与产卵量下降。机理研究表明，沉默Nldesat10引起雌成虫中卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg）、卵黄原蛋白受体（Vitellogenin Receptor，VgR）、雷帕霉素靶标（Target of Rapamycin，TOR）以及载脂蛋白（Lipophorin，Lpp）等基因的转录水平下调，但不影响保幼激素酸甲基转移酶(juvenile hormone acid methyltransferase，JHAMT)、保幼激素酯酶(juvenilehormone esterase，JHE)、甲氧普林耐受基因(Methoprene-tolerant，Met)、脑部富集RaS同系物(Ras homologue enriched in brain，Rheb、S6激酶(S6 kinase，S6K)、脂动激素(adipokinetic hormone，AKH)及脂动激素受体(adipokinetichormone receptor，AKHR)等基因的表达水平;表明沉默Nldesat10引起的卵黄原蛋白转录水平以及褐飞虱雌成虫繁殖力下降，主要可能是由于弱化了TOR通路以及载脂蛋白。
　　比较了沉默Nldesat10的褐飞虱在取食人工饲料和取食水稻时存活率的差异，结果表明取食人工饲料的褐飞虱校正存活率显著高于取食水稻的。与对照褐飞虱取食的水稻相比，沉默Nldesat10褐飞虱取食水稻的茉莉酸(jasmonic acid，JA)和茉莉酸-异亮氨酸结合物(jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile)含量没有显著变化，但水杨酸(salicylic acid，SA)含量却在取食后8h显著提高。表明Nldeat10除了在褐飞虱存活、繁殖及取食发挥重要作用外，还可能通过调控激发子的生物合成间接地参与调控水稻防御反应。
　　(2)褐飞虱唾液分泌蛋白NlSEF1调控水稻的防御反应
　　鉴定了一个褐飞虱唾液腺高表达基因NlSEF1，其编码蛋白具有EF-hand钙离子结合活性，并能在褐飞虱取食过程中分泌进入水稻。化学分析表明，沉默NlSEF1褐飞虱取食比对照褐飞虱取食能诱导水稻产生更高的Ca2+和H2O2浓度，但诱导的JA、JA-Ile和SA含量没有显著差异;与此相一致，外用原核表达的NlSEF1处理水稻不影响JA、JA-Ile和SA的积累，但却显著抑制H2O2的产生。这些结果表明褐飞虱唾液蛋白NlSEF1作为调控水稻防御反应的效应子在褐飞虱与水稻互作中具有重要作用。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 去饱和酶及其生物学功能

1．1．1 去饱和酶基因亚家族

1．1．2 昆虫去饱和酶分类

1．1．3 昆虫去饱和酶生物学功能

1．2 植食性昆虫唾液在调控植物防御反应中的作用

1．3 研究目的与意义

2 褐飞虱去饱和酶基因分析及生物学功能研究

2．1 材料与方法

2．1．1 供试水稻

2．1．2 供试昆虫

2．1．3 褐飞虱去饱和酶基因的搜索及克隆

2．1．4 褐飞虱去饱和酶基因氨基酸序列及系统进化分析

2．1．5 褐飞虱去饱和酶基因表达模式的荧光定量PCR分析

2．1．6 褐飞虱去饱和酶基因RNA干扰

2．1．7 褐飞虱生物学参数测定

2．1．8 蛋白质含量检测

2．1．9 甘油三酯(Triglyceride)含量检测

2．1．10 水稻信号分子含量测定

2．1．11 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 褐飞虱去饱和酶基因克隆与序列分析

2．2．2 褐飞虱去饱和酶基因的组织特异性定量分析

2．2．3 褐飞虱去饱和酶基因不同发育时期表达模式分析

2．2．4 褐飞虱去饱和酶基因RNAi效果检测及存活率测定

2．2．5 干扰Nldesat10阻碍褐飞虱卵巢发育

2．2．6 干扰Nldesat10下调TOR基因和载脂蛋白基因表达

2．2．7 干扰Nldesat10降低褐飞虱蛋白质及甘油三酯含量

2．2．8 干扰Nldesat10降低褐飞虱取食量及体重

2．2．9 干扰褐飞虱去饱和酶Nldesat10诱导水稻SA积累

2．3 讨论

3 唾液蛋白NlSEF1在褐飞虱调控水稻防御中的作用

3．1 材料与方法

3．1．1 供试水稻

3．1．2 供试昆虫

3．1．5 NlSEF1蛋白原核表达

3．1．6 NlSEF1蛋白钙离子结合功能验证

3．1．7 水稻胞内钙离子检测

3．1．8 水稻信号分子含量测定

3．1．9 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．2 褐飞虱唾液蛋白NlSEF1基因RNAi沉默效率及表型

3．2．3 褐飞虱唾液蛋白NlSEF1具有钙离子结合能力

3．2．4 褐飞虱唾液蛋白NlSEF1调控水稻胞质钙离子水平下降

3．2．5 褐飞虱唾液蛋白NlSEF1抑制水稻过氧化氢积累

3．3 讨论

4 全文总结与展望

4．1 全文总结

4．2 创新之处

4．3 下一步研究计划

参考文献