基于手机的智能传感技术及其海洋生物毒素现场快速检测的研究

摘要

随着人类社会现代化的快速发展，人类活动越发频繁，导致海洋环境污染日趋严重，含有海洋生物毒素超标的海洋水产品不断增多，严重影响我国水产养殖业和进出口贸易，甚至危害人类的公共安全。因此，急需一种简便、快速，能用于现场检测的技术手段来满足海洋生物毒素日常监测的需求。智能传感技术集成了采集、处理、交换信息的功能，配合智能检测方法可以模拟人的感官功能，具有非破坏性、分析速度快、易检测、低成本、高灵敏度、高特异性和高重复性等特点，目前已广泛应用于临床诊断、生命分析、食品安全和环境保护等领域。因此，发展一种小型、便携、操作简单的光学检测系统，结合生物传感技术，并将其用于海洋生物毒素的现场快速检测，具有巨大的科研、应用、商业和社会公益价值。
　　本文以光致光学生物传感检测技术为基础，设计并实现了基于手机的智能高通量同时检测光学系统仿生电子眼(Bionic e-Eye)和手持式智能快速检测光学系统。本文将Bionic e-Eye与酶联免疫检测技术结合，实现了对贝类毒素的高通量快速定量分析。此外，本文以细胞作为敏感元件研制了细胞活性传感器，并将其与Bionic e-Eye结合，研究将细胞传感器用于现场快速检测的新方法。最后，本文研制了两种定量胶体金免疫层析试纸条，并将其与手持式智能快速检测系统相结合，研究了用于海洋生物毒素现场快速检测并易于推广的简便方法。
　　本文的主要创新性研究工作包括:
　　1、提出了一种基于手机的智能检测光学系统的设计方法，采用HSV仿生颜色模型用于比色分析，提高了系统检测的灵敏度
　　本文基于吸光光度分析检测技术原理，结合图像处理技术，设计并实现了基于手机的智能高通量同时检测光学系统Bionic e-Eye。依据不同的检测场景，完成了两款智能手机移动应用程序，iPlate和iPlate Monitor，分别实现了对显色生化反应的快速检测及长时监测。引入HSV（色调，饱和度，明度）颜色模型提高了系统仪器的灵敏度。同时以颜色通道强度时间稳定性测试及二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测实验来测试了系统性能。实验结果表明，Bionic e-Eye采用HSV模型较传统RGB（红，绿，蓝）模型，在BCA检测的灵敏度方面提高了3倍以上。
　　2、提出了一种基于Bionic e-Eye结合ELISA的检测方法，实现了海洋生物毒素的高通量同时现场快速检测
　　本文利用间接竞争性抑制免疫传感检测原理的试剂盒，对毒素分子特异性识别，再使用Bionic e-Eye进行高灵敏高通量同时检测。系统采用性能最好的S分量对腹泻性贝毒大田软海绵酸(OA)和麻痹性贝毒石房蛤毒素(STX)检测，检测限分别为0.0854ng/mL和0.0092ng/mL，检测范围分别为0.2～5ng/mL和0.02～0.32ng/mL，回收率分别在95.20～109.72％和90.19～112.15％内。加标回收率及实际贝肉样品检测实验的结果说明了Bionic e-Eye与标准仪器酶标仪之间具有直接相关性，相对误差对于OA和STX的检测分别在5.30％和10.43％以内。系统采用图像检测技术实现高通量同时检测，降低了传统依靠机械移动平台所造成的孔间误差，并且系统具有低成本、便携性和耗时短等特点，表明该方法适用于海洋生物毒素的高通量同时现场快速检测。
　　3、提出了一种基于Bionic e-Eye结合细胞活性传感器的检测方法，提供了一种用于海洋毒素的现场快速检测，具有生物毒性评价功能的可行方案
　　本文设计并研制了CVB，并与Bionic e-Eye结合，研究了一种具有生物功能性评价的现场快速检测分析方法。CVB是以活细胞为敏感元件，细胞计数试剂(CCK-8)为二级换能器，将细胞的活性参数转换为光学信号的细胞传感器。采用人肝癌细胞株细胞(Hep G2)和人单核巨噬细胞(THP-1)分别构建CVB，并对细胞培养密度优化，得出最佳细胞接种密度为4000cells/well和8000cells/well。所构建的HepG2-CVB和THP-1-CVB能够在5～200ng/mL范围内特异性检测OA，最佳检测时间分别为2.87h和3.33h，检测限分别为3.4083ng/mL和13.4456ng/mL。结果表明CVB在活细胞选择上，对贴壁细胞和悬浮细胞具有通用性，并且该方法是一种便携、低成本、操作简便和高效率的检测方法，能用于海洋生物毒素的现场快速、高灵敏和高特异性的检测。
　　4、研制了一种结合胶体金免疫层析试纸条的手持式智能快速检测系统，满足了海洋毒素现场检测对操作简便的实用性要求
　　本文依据竞争性免疫反应，设计并制备了OA和STX两类定量胶体金免疫层析试纸条。并且基于反射式光度计检测原理，为满足基层对具有手持式、低成本和能用于现场检测技术的需求，设计并实现了手持式智能快速检测光学系统。系统检测OA和STX的检测范围分别为3～20ng/mL和6.25～100ng/mL，检测限分别为2.4516ng/mL和5.141ng/mL。与酶联免疫检测法对比，相对误差在8％以内。并且与小鼠生物法(MBA)、色谱质谱联用分析法(LC-MS/MS)等比较，系统具有成本低、集成度高、操作简单和检测速度快等优势。结果表明，结合胶体金免疫层析试纸条的手持式智能快速检测光学系统适用于海洋生物毒素的现场快速检测及其推广。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 光学生物传感检测概述

1．2 光学生物传感检测的分类

1．2．1 无源光学生物传感检测

1．2．2 电致光学生物传感检测

1．2．3 光致光学生物传感检测

1．3 基于手机的智能传感技术概述

1．3．1 基于手机的智能电化学生物传感技术

1．3．2 基于手机的智能光学生物传感技术

1．4 海洋生物毒素检测概述

1．4．1 海洋生物毒素分类

1．4．2 海洋生物毒素的生物学检测方法

1．4．3 海洋生物毒素的化学分析检测方法

1．5 本文主要研究内容

第二章 基于手机的智能高通量同时检测光学系统Bionic e-Eye

2．1 吸光光度分析检测技术

2．2 智能高通量同时检测光学系统Bionic e-Eye设计

2．2．2 Bionic e-Eye的硬件设计

2．2．3 Bionic e-Eye的智能手机App-iPlate设计

2．2．4 Bionic e-Eye的智能手机App-iPlate Monitor设计

2．3 智能高通量同时检测光学系统Bionic e-Eye的性能测试

2．3．1 颜色通道强度时间稳定性测试

2．3．2 BCA蛋白检测的生化分析性能测试

2．4 小结

第三章 结合试纸条的手持式智能快速检测光学系统

3．1 免疫胶体金层析检测技术

3．2 手持式智能快速检测光学系统的设计

3．2．1 手持式智能快速检测光学系统的总体设计

3．2．2 手持式智能快速检测光学系统的硬件设计

3．2．3 手持式智能快速检测光学系统的智能手机App-iStrip设计

3．3 手持式智能快速检测光学系统的性能测试

3．4 小结

第四章 Bionic e-Eye结合ELISA的海洋生物毒素检测方法的研究

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 实验试剂和耗材

4．2．2 间接竞争性抑制免疫传感检测原理

4．2．3 贝肉提取液准备

4．2．4 OA试剂盒检测流程

4．2．5 STX试剂盒检测流程

4．2．6 加标回收率检测

4．3 结果与分析

4．3．1 OA标准曲线标定

4．3．2 OA加标回收率结果分析

4．3．3 实际贝肉样品检测OA结果分析

4．3．4 STX标准曲线标定

4．3．5 STX加标回收率结果分析

4．3．6 实际贝肉样品检测STX结果分析

4．4 小结

第五章 Bionic e-Eye结合CVB的海洋生物毒素现场快速生物毒性评价的研究

5．1 引言

5．2 实验方法

5．2．1 实验试剂和耗材

5．2．2 CVB的检测原理

5．2．3 细胞培养

5．2．4 贝肉提取液准备

5．2．5 检测溶液准备

5．2．6 细胞活性监测

5．2．7 CVB用于OA的现场快速检测

5．2．8 OA对细胞形态的影响

5．2．9 加标回收率检测

5．3 结果与分析

5．3．1 CVB的构建与优化

5．3．2 CVB检测OA结果分析

5．3．3 传感器的特异性分析

5．3．4 OA对细胞形态的影响结果

5．3．5 加标回收率结果分析

5．3．6 CVB用于OA现场快速检测的讨论

5．4 小结

第六章 手持式智能快速检测光学系统用于海洋生物毒素现场快速检测的研究

6．1 引言

6．2 实验方法

6．2．1 实验试剂和耗材

6．2．2 毒素标准品溶液及贝肉提取液准备

6．2．3 免疫胶体金层析试纸条的设计和制备

6．2．4 手持式智能快速检测光学系统用于OA的检测

6．2．5 手持式智能快速检测光学系统用于STX的检测

6．3 结果与分析

6．3．1 OA标准曲线标定

6．3．2 手持式智能快速检测光学系统检测OA的特异性分析

6．3．3 实际贝肉样品中OA检测结果分析

6．3．4 STX标准曲线标定

6．3．5 手持式智能快速检测光学系统检测STX的特异性分析

6．3．6 实际贝肉样品中STX检测结果分析

6．3．7 手持式智能快速检测光学系统与其他检测方法比较讨论

6．4 小结

第七章 总结与展望

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

主要名词缩写

作者简历

攻读学位期间发表的学术论文及科研成果