唾液酸介导药物递送系统的急性肾损伤靶向治疗研究

摘要

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是一种肾功能在短期内急性减退的临床综合，尽管AKI治疗手段在不断地改进，但该疾病的发病率和死亡率仍然很高，这使得全世界的临床医师越来越多地关注AKI，旨在寻找更为有效的治疗手段用于AKI。近年研究发现肾脏血管内皮细胞损伤是引起AKI的重要原因，因此，从逆转细胞损伤过程入手，借助纳米给药系统将药物主动转运至靶细胞，更为有效地促使胞内药物通过降低炎症因子、减轻氧化应激损伤和改善细胞凋亡等途径入手寻找一种有效治疗AKI的手段具有十分重要的研究价值与临床意义。本研究以人体内源性物质唾液酸(Sialic Acid，SA)为靶向基团，构建唾液酸介导的药物递送系统，通过增加药物在肾脏部位的有效蓄积实现AKI的安全、高效治疗。
　　采用唾液酸、聚乙二醇和地塞米松为原料合成了唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(Sialic acid-polyethylene glycol-dexamethasone，SA-PEG-DXM)嫁接物，得到的嫁接物材料在水性介质中具有较强的自聚集能力(临界胶束浓度:63.9±4.1μg/mL)，形成以地塞米松为疏水性内核，唾液酸-聚乙二醇为亲水性外壳的空白胶束，粒径在50nm左右，且分布均匀。嫁接物中地塞米松含量为15.9±2.4％，体外释放结果显示地塞米松体外释放时间超过48h，具有较好的缓释作用。采用溶剂扩散法可进一步物理包载地塞米松，得到唾液酸-聚乙二醇-地塞米松(SA-PEG-DXM/DXM)载药胶束。当投药量为10％时，得到药物总含量为22.5±2.1％的载药胶束，粒径均在30nm左右，呈较规则的球形。体外释放研究结果表明包载于胶束中的地塞米松释放主要在集中在前24h，这使得SA-PEG-DXM/DXM载药胶束成为兼具物理包裹和化学嫁接双重释药特征的药物递送系统。
　　以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型细胞对嫁接物细胞毒性进行考察，结果显示其在1～800μg/mL浓度范围内对细胞的生长及增殖均无影响，可满足作为药物载体生物相容性的要求。采用100ng/mL脂多糖刺激HUVECs构建E-selectin受体高表达的体外炎症细胞模型用于考察SA-PEG-DXM嫁接物胶束的主动靶向能力，以聚乙二醇-地塞米松(PEG-DXM)嫁接物胶束为对照，结果表明炎症HUVECs对唾液酸修饰的嫁接物胶束具有更好的摄取行为，且胞内嫁接物胶束分布情况与细胞表面E-selectin受体表达量一致;采用游离唾液酸阻断细胞表面E-selectin受体后，炎症细胞对SA-PEG-DXM嫁接物胶束的摄取量降低，进一步证实SA-PEG-DXM嫁接物胶束的炎症血管内皮细胞主动转运是唾液酸与E-selectin受体相互作用的结果。采用肾脏注射脂多糖构建AKI动物模型，尾静脉给药考察包载荧光探针的嫁接物胶束在模型动物体内的分布情况，结果显示SA-PEG-DXM嫁接物胶束在AKI小鼠肾脏的分布显著高于PEG-DXM嫁接物胶束及SA-PEG-DXM嫁接物胶束在正常小鼠肾脏的分布。
　　采用ICR小鼠为模型动物，通过肾脏注射脂多糖构建AKI动物模型，考察游离地塞米松、PEG-DXM/DXM载药胶束和SA-PEG-DXM/DXM载药胶束在模型动物的体内药效。分别在给药后第2d和第7d对模型动物肾脏指数、肾功能指标、炎症因子和氧化应激水平进行考察，结果发现给药后第2d，SA-PEG-DXM/DXM载药胶束明显减轻动物肾脏水肿、降低血肌酐和尿素氮水平、抑制炎症因子产生及改善氧化应激状态，并且在第7d的疗效更为显著。采用HE和PAS染色法对模型动物肾脏组织病理形态进行考察，SA-PEG-DXM/DXM载药胶束较其他制剂更为有效地改善小鼠肾脏组织肾小管扩张、肾间质水肿和炎症细胞浸润等。采用TUNEL法和免疫印迹法对肾脏组织细胞凋亡情况进行考察，结果同样显示SA-PEG-DXM/DXM载药胶束显著可改善改善肾脏组织细胞凋亡程度。
　　在唾液酸介导的药物递送系统成功实现急性肾损伤靶向治疗的基础上，以对炎症微环境中高浓度的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）特异性敏感的PVGLIG多肽作为葡聚糖和姜黄素间的链段，合成唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素(SA-DEX-PVGLIG-CUR)聚合物前药。采用荧光分光光度法测得SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前药中姜黄素的含量为5.38±0.25％，体外释放实验证实SA-DEX-PVGLIG-CUR聚合物前药在MMP-2酶的作用下可有效释放药物，姜黄素在48h内的累积释放量达到84.4±5.1％，而对MMP-2酶无响应性SA-DEX-CUR聚合物前药在同时间的累积释放量仅为63.2±4.8％。
　　在脂多糖预处理的血管内皮细胞(HUVECs)和肾小管上皮细胞（HK-2）共培养体系中，SA-DEX-PVGLIG-CUR可主动靶向于炎症HUVECs;AKI模型动物体内分布结果显示，唾液酸介导的聚合物前药具有良好的肾脏靶向能力:给药后24h，SA-DEX-PVGLIG-CUR在肾脏的分布量分别是游离姜黄素和DEX-PVGLIG-CUR的16.2倍和3.1倍，并且在肾脏的维持时间超过48h。在炎症微环境中MMP-2酶作用下，SA-DEX-PVGLIG-CUR还可响应性地释放出游离姜黄素，增加药物在HK-2细胞中的分布。采用激光共聚焦显微镜同样观察到在给予SA-DEX-PVGLIG-CUR的模型动物肾小管中姜黄素的分布量要明显高于SA-DEX-CUR，从细胞和动物水平证明具有炎症微环境响应性释药特征的SA-DEX-PVGLIG-CUR可增加药物在肾脏部位其他功能细胞中的药物分布。采用ICR小鼠为模型动物，通过肾脏注射LPS构建AKI动物模型，通过尾静脉注射给药，考察游离姜黄素、SA-DEX-CUR和SA-DEX-PVGLIG-CUR的体内疗效。给药48h后，各项体内药效学评价指标证明SA-DEX-PVGLIG-CUR对AKI具有最佳的治疗效果，包括肾脏指数、肾功能指标、炎症因子、氧化应激及组织病理学形态。
　　综上所述，本课题所设计的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束和唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药在急性肾损伤模型小鼠体内，通过其良好的肾脏分布和释药特性，提高药物的治疗效果。有望通过药物的肾脏靶向蓄积，减少给药频率，实现对急性肾损伤的安全、有效治疗。

目录

声明

致谢

摘要

目次

引言

第1章 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成及理化性质评价

1．1 试剂与仪器

1．1．2 仪器

1．2 实验方法

1．2．4 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶束浓度测定

1．2．7 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中地塞米松含量测定

1．2．8 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中地塞米松的体外释放行为考察

1．3 结果与讨论

1．3．2 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构确证

1．3．3 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶束浓度测定

1．3．4 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的粒径及形态学观察

1．3．5 地塞米松含量测定方法学研究结果

1．3．6 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中地塞米松的含量测定

1．3．7 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中地塞米松的体外释放研究

1．4 本章小结

第2章 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的制备及理化评价

2．1 试剂与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．2 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的粒径与表面电位测定

2．2．6 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的体外稳定性研究

2．3 结果与讨论

2．3．2 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的理化性质考察

2．3．3 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的载药量测定

2．3．4 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的体外释放行为研究

2．3．5 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的稳定性研究

2．4 本章小结

第3章 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的体内分布研究

3．1 试剂与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 仪器

3．1．3 实验动物

3．2 实验方法

3．2．3 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的细胞摄取研究

3．2．4 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的细胞定量摄取研究

3．2．8 免疫组化法考察急性肾损伤模型小鼠肾脏的E-selectin受体表达

3．2．9 免疫印迹法考察急性肾损伤模型小鼠肾脏的E-selectin受体表达

3．2．10 载吲哚菁绿的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束制备

3．2．11 模型动物体内分布考察

3．3 结果与讨论

3．3．2 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的细胞摄取研究

3．3．3 细胞表面E-selectin受体介导内吞研究

3．3．4 急性肾损伤模型动物体内肾脏E-selectin受体表达情况考察

3．3．5 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶束的体内分布研究

3．4 本章小结

第4章 唾液酸-聚乙二醇-地塞米松载药胶束的药效学研究

4．1 试剂与仪器

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．1．3 实验动物

4．2 实验方法

4．2．1 急性肾损伤模型动物构建及治疗方案

4．2．2 肾功能指标考察

4．2．3 肾组织病理学考察

4．2．4 肾脏组织炎性因子检测

4．2．5 肾脏组织氧化应激水平考察

4．2．6 TUNEL

4．2．7 凋亡相关蛋白测定

4．2．8 统计学处理

4．3 结果与讨论

4．3．1 肾脏指数变化

4．3．2 肾功能指标变化

4．3．3 肾脏组织炎症因子水平变化

4．3．4 肾脏组织氧化应激水平

4．3．5 肾脏组织形态学变化

4．3．6 TUNEL法检测肾脏组织凋亡

4．3．7 凋亡相关蛋白测定

4．4 本章小结

第5章 唾液酸介导的炎症内环境响应性前体药物的构建及其释药特性研究

5．1 试剂与仪器

5．1．1 材料

5．1．2 仪器

5．2 实验方法

5．2．1 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的合成

5．2．2 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的结构确证

5．2．5 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的体外释放行为考察

5．3 结果与讨论

5．3．1 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的合成结构确证

5．3．2 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的溶解度测定

5．3．4 MMP-2酶响应性体外释放考察

5．4 本章小结

第6章 唾液酸介导的炎症内环境响应性前体药物的体内分布研究

6．1 试剂与仪器

6．1．1 材料

6．1．2 仪器

6．1．3 实验动物

6．2 实验方法

6．2．1 细胞毒性研究

6．2．2 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的细胞摄取研究

6．2．4 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的体内分布

6．2．5 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的体内释药

6．3 结果与讨论

6．3．1 载体材料的细胞毒性

6．3．2 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素的细胞摄取研究

6．3．3 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药的体内分布研究

6．3．4 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药体内释药

6．4 本章小结

第7章 唾液酸介导的炎症内环境响应性前体药物的药效学研究

7．1 试剂与仪器

7．1．1 材料

7．1．2 仪器

7．2 实验方法

7．2．1 细胞增殖

7．2．3 肾功能指标考察

7．2．4 肾组织病理学考察

7．2．5 肾脏组织炎性因子检测

7．3．1 唾液酸-葡聚糖-PVGLIG多肽-姜黄素聚合物前药改善细胞活性

7．3．2 肾脏指数变化

7．3．3 肾功能指标变化

7．3．4 肾脏组织炎症因子水平变化

7．3．5 肾脏组织氧化应激水平

7．3．6 肾脏组织形态学变化

7．4 本章小结

结论

参考文献

综述

作者简历