cRGD修饰的Mpeg-plga-pll靶向纳米药物递送系统对乳腺癌的治疗研究

摘要

近年来，靶向抗肿瘤治疗模式逐渐成为临床“新宠”，在提高疗效的同时，可以大幅度减低患者发生副作用的风险。因此在科学家探索癌症治疗的各种策略中，肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。靶向治疗领域中关于载体的研究始终是人们关注的焦点。寻找对肿瘤细胞有特异性的载体构建靶向递送系统，将药物递送到肿瘤部位，使肿瘤局部药物浓度增加，达到选择性杀灭的目的。
　　 本论文中设计合成了缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽(VRGDG，cRGD)修饰的单甲醚-聚乙二醇-聚（丙交酯-乙交酯）-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL)聚合物材料(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)。以合成的聚合物材料为载体构建靶向纳米递送系统。并对构建的靶向纳米递送系统的生物相容性进行了初步评价，观察了靶向纳米递送系统的肿瘤靶向性，研究了其对乳腺癌动物模型的治疗效果。
　　 本论文的主要研究结果如下:
　　 设计并合成了聚合物材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD，用红外光谱、核磁共振等测试手段对合成的产物进行了结构表征。以合成的聚合物材料为载体，以DHAQ为模型药，用乳化-溶剂蒸发法制备出载体材料的空白纳米粒（mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGDNPs）和载DHAQ的纳米粒（DHAQ-mPEG-PLGA-PLL和DHAQ-mPEG-PLGA-PLL-cRGDNPs）。对纳米粒的制备工艺进行了研究，其工艺的优化条件是:材料浓度为20mg/mL，乳化剂F68浓度为0.5％，超声强度为400W，内水相/外水相的体积比为1∶10。制备的纳米粒大小均匀，粒径在180nm左右，包封率为85.3％。
　　 通过MTT法测试了空白纳米粒和载DHAQ的纳米粒细胞的毒性。实验结果表明，空白纳米粒对MDA-MB-231乳腺癌细胞存活率的影响较小，表明材料几乎无细胞毒性。载DHAQ纳米粒可以有效降低MDA-MB-231乳腺癌细胞存活率。通过溶血率法测试了空白纳米粒的溶血率。实验结果表明，空白纳米粒的溶血率＜5％，符合材料溶血率的要求。表明纳米粒具有良好的生物相容性。
　　 通过激光共聚焦显微镜观察了MDA-MB-231乳腺癌细胞摄取纳米粒的分布。实验结果表明，被摄入到细胞中的纳米粒主要分布在细胞浆中，少量的分布在细胞核中。
　　 通过细胞摄取纳米粒定量分析实验，检测了纳米粒所递送到MDA-MB-231乳腺癌细胞中的药物浓度。实验结果表明，与DHAQ-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，DHAQ-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒能更有效被细胞摄取，从而导致其递送到细胞中的药物浓度显著增高。
　　 将罗丹明B(Rb)作为荧光探针包裹纳米粒中来研究细胞摄取纳米粒的通路。实验结果表明，与Rb-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，Rb-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒能更高效地与MDA-MB-231乳腺癌细胞结合。Rb-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒主要是通过纳米粒上cRGD与细胞表面的整合素αvβ3的结合来靶向细胞，之后再通过细胞质微囊介导的内吞被摄入到细胞内。Rb-mPEG-PLGA-PLL纳米粒则是直接通过细胞质微囊介导的内吞和细胞胞饮被摄入到细胞内。通过活体靶向荧光成像技术，观察了荧光纳米粒在尾静脉注射后的2、12、24和48h时对肿瘤组织的靶向效果。实验结果表明，与Rb-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，Rb-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒在体内具有更理想的循环时间和靶向效果。通过高效液相色谱仪来分析检测了载药纳米粒在尾静脉注射后的2、12、24和48h时的体内药物分布。通过对体内药物浓度的精确测量，用来进一步量化、验证活体靶向荧光成像实验结果。实验结果表明，与DHAQ-mPEG-PLGA-PLL纳米粒相比，mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒能有效提高荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠肿瘤中的药物浓度。表明DHAQ-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒靶向肿瘤的效果较好。
　　 对荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠进行为期36天的治疗实验结果表明，DHAQ、DHAQ-mPEG-PLGA-PLL和DHAQ-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒的抑瘤率分别是9.09％，40.46％和69.77％，表明DHAQ-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒具有更理想的抑瘤效果。
　　 以上的实验结果表明，mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米递送系统是具有潜在应用前景的靶向递送系统。

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摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 靶向纳米递送系统的分类

1．3 靶向纳米递送系统的设计原理

1．3．1 通过控制靶向递送系统的粒径大小，利用EPR效应来设计被动靶向递送系统

1．3．2 通过用聚乙二醇(PEG)修饰来设计长循环被动靶向递送系统

1．3．3 通过抗原-抗体、受体-配体对靶细胞分子水平识别能力来设计主动靶向递送系统

1．3．4 通过体外磁场的引导来进行设计靶向递送系统

1．4 靶向纳米递送系统靶向性的影响因素

1．4．1 免疫生理调节

1．4．2 靶向纳米递送系统的特性

1．5 靶向纳米递送系统在肿瘤治疗和成像中的应用

1．5．1 靶向纳米递送系统与肿瘤治疗

1．5．2 靶向纳米递送系统与肿瘤成像

1．6 本论文的主要研究内容、研究目的和意义

1．6．1 本论文的主要研究内容

1．6．2 本论文的主要研究目的和意义

参考文献

第二章 mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物材料的合成

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验原料

2．2．3 合成mPEG-PLGA-PLL-cRGD路线图

2．2．4 合成mPEG-PLGA

2．2．5 合成mPEG-PLGA-Phe-Boc

2．2．6 合成mPEG-PLGA-Phe-NH2

2．2．7 合成mPEG-PLGA-PLL-Nε-cbz

2．2．8 合成mPEG-PLGA-PLL

2．2．9 合成mPEG-PLGA-PLL-cRGD

2．2．10 化学结构表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 合成mPEG-PLGA

2．3．2 合成mPEG-PLGA-Phe-Boc

2．3．3 合成mPEG-PLGA-Phe-NH2

2．3．4 合成mPEG-PLGA-PLL-Nε-cbz

2．3．5 合成mPEG-PLGA-PLL

2．3．6 合成mPEG-PLGA-PLL-cRGD

2．4 本章小结

参考文献

第三章 纳米粒的制备及其理化性质的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验原料

3．2．3 空白纳米粒制备

3．2．4 载DHAQ的纳米粒制备

3．2．5 制备纳米粒的单因素考察

3．2．6 正交设计优化纳米粒的制备工艺

3．2．7 纳米粒的表征

3．2．8 纳米粒中药物浓度的测定

3．2．9 纳米粒体外药物释放的测定

3．2．10 冻干保护剂的考察

3．3 结果与讨论

3．3．1 制备纳米粒的单因素考察结果

3．3．2 正交设计优化纳米粒的制备工艺结果

3．3．3 纳米粒的表征结果

3．3．4 纳米粒中药物浓度的测定结果

3．3．5 纳米粒体外药物释放的测定结果

3．3．6 冻干保护剂的考察结果

3．4 本章小结

参考文献

第四章 纳米粒与MDA-MB-231乳腺癌细胞体外实验的研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验原料

4．2．3 实验动物和细胞

4．2．4 细胞存活率实验

4．2．5 溶血率实验

4．2．6 细胞摄取纳米粒实验观察

4．2．7 细胞摄取纳米粒定量分析实验

4．2．8 细胞摄取纳米粒通路实验

4．2．9 实验数据处理

4．3 结果与讨论

4．3．1 细胞存活率实验结果

4．3．2 溶血率实验结果

4．3．3 细胞摄取纳米粒实验观察结果

4．3．4 细胞摄取纳米粒定量分析实验结果

4．3．5 细胞摄取纳米粒通路实验结果

4．4 本章小结

参考文献

第五章 纳米粒在荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠体内分布及其治疗效果的研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验原料

5．2．3 实验动物和细胞

5．2．4 实验动物喂养

5．2．5 荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠肿瘤模型的建立

5．2．6 活体靶向荧光成像实验

5．2．7 体内药物分布实验

5．2．8 治疗效果实验

5．2．9 实验数据处理

5．3 结果与讨论

5．3．1 活体靶向荧光成像实验结果

5．3．2 体内药物分布实验结果

5．3．3 治疗效果实验结果

5．4 本章小结

参考文献

第六章 全文总结及展望

6．1 总结

6．2 展望

攻读博士学位期间发表及待发表的论文及专利

致谢