高三尖杉酯碱治疗急性髓细胞白血病的DNA表观基因组相关分子机制

摘要

高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)最初是从海南三尖杉中分离得到的具有细胞毒性的生物碱，已经被美国食品和药物管理局(Food and Drugadministration，FDA)批准用于治疗酪氨酸激酶抑制剂耐药或不耐受的慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)，尚未批准用于治疗急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)。但是在中国，HHT由于其廉价高效的优点，近四十年内一直被用于治疗AML。2006年，创新性地在浙江省发起一项基于HHT的临床研究，采用HAA诱导化疗方案(HHT4mg/m2/day，第1-3天;阿糖胞苷150mg/m2/day，第1-7天;阿柔比星12mg/day,第1-7天)治疗初发AML，取得83％的完全缓解率。此后，开展了一项多中心、开放、随机、对照的3期临床试验，证实了改良的HAA诱导化疗方案(HHT2mg/m2/day，第1-7天;阿糖胞苷100mg/m2/day，第1-7天;阿柔比星20mg/day，第1-7天)可以用作初发AML的候选诱导方案，特别是预后分类为好或中等的患者。在CML中，HHT主要通过与核糖体A位点的结合抑制蛋白质的合成，然而在AML中，HHT相关的治疗机制仍不十分明确。 AML是最常见的造血系统恶性疾病，以髓系分化障碍和未成熟原始髓细胞恶性增殖为特征。现有的治疗方案下，大部分(超过70％)患者存活时间不超过5年。尽管有着共同的髓系背景，分子学和遗传学的异常促成了疾病的异质性和对标准治疗方案的不同应答。随着二代测序技术的发展，一项大规模研究报道在1540例AML患者中共检测到5324次突变，其中最常见的突变排名前五的是FLT3、NPM1、DNMT3A、NRAS和复合突变。此外，AML的表观遗传学图谱也逐渐被大家所认知，将包括DNMT3A、TET2、IDH1与IDH2突变在内的与DNA甲基化形成和转化相关的基因定义为一个新的功能性分类。临床上，阿扎胞苷与地西他滨，两种DNA甲基转移酶抑制剂，已被ELN推荐用于治疗不能耐受强烈化疗的AML患者。 目的: 明确HHT体外对不同背景AML细胞系生物学功能改变，并在动物体内实验中进一步验证。分析HHT处理前后，DNA胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine，5mC)和胞嘧啶羟甲基化(5-hydromethylcytosin，5hmC)修饰的改变，探索羟甲基化表达下调的调控机制，并采用分析软件预测调控TET1表达的转录因子。采用shRNA沉默实验观察TET1敲低对于AML细胞株中的生物学功能和对HHT治疗敏感性的改变。采用5hmC测序和RNA测序技术寻找TET1下游的靶基因，进一步分析该靶基因对AML患者治疗应答的影响以及对下游信号通路的调控。 方法： (1)利用体外细胞实验检测不同背景AML细胞系对于HHT治疗的敏感性，HHT对于不同AML细胞系凋亡、周期和分化的影响;采用克隆形成实验检测小鼠原代白血病细胞对于HHT治疗敏感性，进一步应用两种不同的小鼠骨髓移植白血病模型，包括二代MLL-AF9小鼠模型和NSGS异基因移植模型，来评估HHT对于AML的体内治疗作用; (2)运用DNA点印迹杂交实验探索HHT治疗AML过程中，基因组DNA甲基化和羟甲基化的改变，继而通过qPCR方法检测发现TET(ten-eleven translocation)家族成员TET1(而不是TET2/3)水平在HHT治疗后明显下调，并且通过RNA测序数据和Western Blot验证结果。利用体外转录延长试验研究HHT治疗AML时对TET1转录起始水平的影响，经软件预测调控TET1表达的转录因子(靶基因)，采用药物亲和性靶蛋白稳定性实验验证HHT与靶基因的直接结合，同时利用染色质免疫沉淀试验验证该转录因子对于TET1表达水平的调控; (3)利用shRNA构建了TET1敲低的稳转细胞株，通过qPCR和Westernblot检测TET1的敲低效果后，研究TET1敲低对于AML细胞系凋亡、周期和分化的影响，以及TET1敲低对HHT治疗敏感性的改变; (4)采用DNA5hmC测序和RNA测序共同分析探索HHT+TET1/5hmC轴的直接靶点，整合分析HHT处理的AML细胞和既往报道的Tet1敲除细胞的RNA测序数据，确定HHT治疗和Tet1敲除共同的下游信号通路，并应用染色质免疫沉淀试验和Western Blot等多种方法在细胞系中予以验证，最后在相应临床病例和原代病人标本中进行验证。 结果： (1)3种不同基因背景的AML细胞系对HHT治疗敏感，HHT可以显著诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，促进白血病细胞的髓系分化;HHT明显抑制原代细胞克隆形成能力和克隆大小，并表现为剂量依赖的特点;HHT可以有效的延迟两种小鼠模型中AML的发生，抑制白血病的进展和延长AML小鼠的生存; (2)HHT通过靶向作用于SP1/TET1轴显著下调白血病细胞整体5hmC水平; (3)TET1敲低可以很大程度上重复出HHT的功能，包括细胞生长抑制，细胞凋亡的诱导，细胞周期的阻滞以及细胞分化的促进; (4)FLT3是HHT+TET1/5hmC轴重要的直接靶点，MYC是HHT+TET1/5hmC/FLT3轴重要的下游信号基因，伴有FLT3突变的AML细胞和患者对HHT治疗高度敏感。 结论： 本研究中，发现HHT对具有不同背景的AML细胞系体内和体外均有治疗效果。机制上，创新性地发现HHT通过与SP1直接结合抑制TET1的转录效率，TET蛋白家族成员TET1/2/3负责DNA的去甲基化，将基因组DNA中最常见的甲基化修饰类型5mC转化成5hmC。HHT通过靶向作用于SP1/TET1轴显著下调DNA整体5hmC丰度，敲低TET1表达可以模拟HHT对AML的治疗作用。此外，联合分析5hmC和RNA的测序结果，鉴定出FLT3是SP1/TET1信号通路重要的下游基因。临床上，FLT3突变的AML患者表现出对于HHT治疗敏感。综上所述，我们的研究揭示了一项尚未报道的机制，HHT通过抑制SP1/TET1/5hmC/FLT3信号通路治疗AML，且在伴有FLT3突变的患者中治疗效果显著。

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致谢

摘要

英文缩写一览表

引言

第一部分高三尖杉酯碱治疗急性髓细胞白血病的功能研究

1．1前言

1．2材料和方法

1．3结果

1．4讨论

1．5小结

第二部分探索高三尖杉酯碱治疗急性髓细胞白血病对DNA表观基因组的影响及具体调控机制

2．1前言

2．2材料和方法

2．3结果

2．4讨论

2．5小结

全文结论

参考文献

综述

作者简历及在读期期间所取得的科研成果