新型口服环氧酮肽类蛋白酶体抑制剂的设计、合成及生物活性研究

摘要

蛋白酶体作为泛素-蛋白酶体途径(ubiqutin proteasome pathway，UPP)中最为关键的一环，一直以来都是研究的热点。随着第一代蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)以及第二代卡非佐米(carfilzomib)、伊莎佐米(ixazomib)的上市，靶向抑制蛋白酶体各个亚基已被证明是一种有效的癌症治疗策略。然而，临床研究表明，上市的蛋白酶体抑制剂仍然存在周围神经病变、急性弥漫性浸润性肺部疾病、心脏及肝脏毒性以及胃肠道毒性等副作用。因此，开发高效、低毒、可供口服的新型蛋白酶体抑制剂仍然是该靶点的主要研究方向。
　　本文以课题组前期发现的高活性环氧酮肽类化合物E83为先导，针对其不能口服、水溶性较差等缺点，在E83肽骨架的P2和P3残基引入O-甲基丝氨酸，设计、合成了12个含哌啶肽骨架的二肽和三肽衍生物。体外蛋白酶体抑制活性筛选结果表明，二肽化合物的抑酶活性较弱，其对蛋白酶体中ChT-L的IC50值均大于1μM;三肽化合物呈现中等到强的抑酶活性以及对骨髓瘤细胞株RPMI8226、MM.1S的增殖抑制活性。其中，化合物1-64对RPMI8226细胞的增殖抑制活性与先导化合物E83以及卡非佐米相当。体外稳定性实验显示，代表性化合物具有良好的模拟胃肠液(SGF、SIF)稳定性，小鼠肝微粒体(MLM)稳定性和大鼠全血(RWB)稳定性。而且，相比于E83，化合物1-64的水溶性得到显著改善。然而，该类化合物经BABL/c小鼠灌胃给药后，对PBMC中的蛋白酶体抑制效果不明显。虽然口服效果不理想，但是其极佳的抑酶活性、对肿瘤细胞的增殖抑制活性以及改善的溶解度使其具有开发成为静脉注射给药的候选药物潜力。
　　为得到具有口服活性的环氧酮肽类药物，采用基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD）原理，在分析有一定口服活性的候选药物oprozomib与人蛋白酶体共晶结构的基础上，结合电子等排、环肽修饰等药物设计原理，并进一步调整oprozomib的N-末端取代基及肽骨架部分氨基酸残基，对其肽骨架的不同位置进行环合，同时构建了两类、共45个构象限制的大环环氧酮肽类蛋白酶体抑制剂。
　　1)P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类:将oprozomib的P2残基侧链与N-末端连接，通过调整肽骨架上不同氨基酸残基、拓展大环骨架N末端取代基的多样性以及环肽链的连接方式，共设计、合成了38个P2到N-末端的大环衍生物。体外生物活性测试表明，大多数目标化合物均表现出良好的蛋白酶体ChT-L抑制活性，其中，21个化合物的IC50值小于100nM，与阳性化合物oprozomib相当或更优。此外，大部分受试化合物对人血液瘤细胞株RPMI8226、MM.1S、MV-4-11显示出强效的体外增殖抑制活性。小鼠PBMC中蛋白酶体的口服抑制活性显示，化合物2-209在100mg/kg剂量下经灌胃给药后，对蛋白酶体的抑制活性与阳性oprozomib相当。紧接着，开展了2-209对小鼠人多发性骨髓瘤MM.1S皮下移植瘤生长抑制实验，结果显示，两个剂量组(30、60mg/kg)口服给药对荷瘤小鼠仅有微弱的增殖抑制作用。然而，研究中还发现，在同等剂量(30mg/kg)下，2-209对蛋白酶体的抑制活性远低于阳性oprozomib。为探索口服药效及抑制活性较低的原因，测试了2-209的模拟肠液稳定性、Caco2细胞渗透性、初步的药物代谢及小鼠肝微粒稳定性。结果显示，该化合物在模拟肠液中稳定、有一定的细胞渗透性及口服生物利用度，但在小鼠肝微粒体中极不稳定，这可能是造成2-209口服抑制活性低于阳性的原因。为提高该类大环化合物的肝微粒体稳定性，拓展了N-末端取代基的多样性及大环连接链的连接方式。结果显示，N-末端为苯环、取代苯环和吡咯环的化合物在小鼠肝微粒体中极不稳定，N-甲基吡唑(2-206、2-223)、吡唑(2-202)和咪唑环(2-200)则稳定性大大提高，在低剂量下的口服抑制活性也较强。进一步地，优选2-200和2-202测试其在小鼠体内初步的药代情况，结果表明，2-202表现出较好的药代动力学性质。目前，体外活性、稳定性及初步药代动力学较优的化合物2-202的体内药效正在评价中。
　　2)P3到N-末端环合的大环环氧酮肽类:在开展P2到N-末端环合的同时，也开展了将oprozomib的P3残基侧链与N-末端环合的工作。在分析其结构特点及合成难度的基础上，采用将oprozomib的N-末端噻唑环用其生物电子等排体苯环替代这一策略，设计、合成了7个结构新颖的大环肽类衍生物，并以其中的四个未环合前体作为对照。体外生物活性测试表明，目标化合物3-17与未环合前体相比，对蛋白酶体ChT-L的抑制活性相当，对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226、MM.1S显示出了中等强度的增殖抑制活性。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

1 含哌啶肽骨架的环氧酮类蛋白酶体抑制剂的设计、合成与生物活性研究

1．1 蛋白酶体结构与功能

1．2 蛋白酶体抑制剂的临床研究现状

1．3 含哌啶肽骨架的环氧酮类蛋白酶体抑制剂的设计

1．4 含哌啶肽骨架的环氧酮类蛋白酶体抑制剂的合成

1．4．1 苯丙氨酸-环氧酮(Phe-EK)、亮氨酸-环氧酮(Leu-EK)及二肽环氧酮片段(O-甲基-Ser-Phe-EK、O-甲基-Ser-Leu-EK)的合成

1．4．2 含哌啶的氨基酸片段的合成

1．4．3 含哌啶肽骨架的二肽环氧酮类衍生物的合成

1．4．4 含哌啶肽骨架的三肽环氧酮类衍生物的合成

1．4．5 目标分子制备过程中的手性纯度控制

1．5 含哌啶肽骨架的环氧酮类衍生物的生物学评价

1．5．1 化合物的蛋白酶体ChT-L抑制活性及人多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制活性测试

1．5．2 代表性化合物的模拟胃肠液稳定性、肝微粒体稳定性、全血稳定性和溶解度测试

1．6 小结

1．7 实验部分

1．7．1 实验材料

1．7．2 合成方法

参考文献

2 P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类蛋白酶体抑制剂的设计、合成及生物活性研究

2．1 P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的设计思路

2．2 P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的合成

2．2．2 二肽片段的合成

2．2．3 芳香羧酸中间体的制备

2．2．4 P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类目标分子的合成

2．3 P2到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的生物学评价及构效关系讨论

2．3．1 目标化合物对蛋白酶体ChT-L的抑制活性及对血液瘤细胞的增殖抑制活性

2．3．2 化合物对正常小鼠PBMC细胞的蛋白酶体ChT-L抑制活性测试

2．3．3 化合物NOD／SCID小鼠人多发性骨髓瘤MM．1S皮下移植瘤生长抑制的药效学研究

2．3．4 Caco-2细胞渗透性实验

2．3．5 模拟肠液(SIF)稳定性

2．3．6 小鼠肝微粒体(MLM)稳定性

2．3．7 化合物溶解度实验

2．3．8 化合物的小鼠口服生物利用度研究

2．4 小结

2．5 实验部分

2．5．2 合成方法

参考文献

3 P3到N-末端环合的大环环氧酮肽类蛋白酶体抑制剂的设计、合成及生物活性研究

3．2 P3到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的合成

3．2．2 P3到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的合成

3．2．3 非环状环氧酮肽类衍生物的合成

3．3 P3到N-末端环合的大环环氧酮肽类衍生物的体外生物学评价

3．3．1 目标化合物对蛋白酶体ChT-L的抑制活性及对骨髓瘤细胞RPMI-8226、MM．1S的增殖抑制活性

3．4 小结

3．5 实验部分

3．5．1 实验材料

3．5．2 合成方法

4 选择性蛋白酶体抑制剂的研究进展(综述)

附录

作者简历