环丁烯二酮及咪唑酮类选择性CXCR2拮抗剂的设计、合成和生物学评价

摘要

恶性肿瘤是世界范围内非常严重的公共健康问题，其发生发展过程中导致的肿瘤转移是加速肿瘤患者死亡的主要原因之一。CXC趋化因子受体家族中，G-蛋白偶联受体CXCR1与CXCR2蛋白处于细胞内外信号转导通路中的关键位置，CXCR1与CXCR2具有77％的同源性，在肿瘤微环境中被自分泌或旁分泌趋化因子激活后，对肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管增生等具有重要影响。近年来研究表明，CXCR2与肿瘤转移关系更加密切，并且在肿瘤免疫疗法中介导免疫逃逸，而开发选择性靶向CXCR2拮抗剂已成为抗肿瘤转移药物研发热点，同时其与免疫疗法联用也有望成为一种有效的癌症治疗策略。
　　根据文献调研，本文以环丁烯二酮衍生物CXCR1/2拮抗剂SCH527123为先导，在分析其结构特点的基础上，在其基本骨架中引入桥环片段，构建了一系列新型含桥环环丁烯二酮类衍生物。经生物评价-结构优化，合成了31个环丁烯二酮衍生物，体外活性评价表明，大多数化合物具有中等到强的CXCR2拮抗活性，发现了3个活性和选择性各有优势的化合物。
　　代表性化合物1-25（CXCR2IC50=48nM，CXCR1/CXCR2选择性为60倍）在不同浓度条件下对高转移肺癌细胞株H1299、胰腺癌细胞株BXPC3和CFPAC1均分别表现出47％、14％和20％的迁移抑制活性。化合物1-25在模拟肠液、模拟胃液、大鼠血浆和人血浆中稳定性良好，但肝微粒（大鼠、小鼠和人）中不稳定性呈现了种属差异。化合物1-25在大鼠中表现了较好的药代动力学性质，10mg/kg给药后，其Cmax、AUC0-t和t1/2分别为2863ng/mL、8820h·ng/mL和2.58h。除此之外，本文通过同源模建的形式，预测了化合物1-25的两种构型与CXCR2蛋白的结合模式，发现关键氨基酸残基Tyr314、Ser81、Ala249和Val252等均参与了分子-蛋白相互作用，且化合物1-25的S构型较R构型与蛋白结合更强，对CXCR2蛋白拮抗活性可能会更好，为化合物1-25的进一步开发奠定了基础。
　　与此同时，为了开发结构新颖、成药性优异的选择性CXCR2拮抗剂，本文基于“从头设计”理念，采用Discovery Studio2.5软件构建了基于结构的药效团模型，通过对分子库筛选，结构优化发现了新型咪唑酮类选择性CXCR2拮抗剂。共设计合成了37个化合物。
　　第一阶段，构建了基于配体的药效团模型Hypo1，并通过诱饵集验证。基于CXCR2拮抗剂构效关系，设计了包含11种骨架类型的多样性化合物虚拟库，采用Hypo1进行筛选。根据筛选结果，设计并合成了三氮唑酮及三氮唑类共12个化合物进行体外CXCR2拮抗活性评价。代表性化合物2-12对CXCR2具有一定的拮抗活性（CXCR2IC50=15μM），在50μg/mL浓度下对肺癌细胞株H1299的迁移抑制率为72％。
　　第二阶段，基于化合物2-12与药效团的叠合模型，在分子的三氮唑片段中引入酮羰基，构建了新型咪唑酮骨架，共设计合成25个化合物。首先发现化合物2-13具有较强的CXCR2拮抗活性及选择性（CXCR2IC50=6nM，CXCR1/CXCR2选择性为778倍），但该分子由于咪唑酮5位手性碳上活泼氢的存在，易消旋化，且在模拟肠液中稳定性差。针对分子的这一特点，开展了系统的结构优化，发现咪唑酮3位芳胺中的砜基引入长链取代基有利于提高化合物CXCR2选择性，部分咪唑酮5位为脂肪基团的化合物不仅显示出较高的CXCR2的拮抗活性及亚型选择性，且在模拟肠液及胃液中稳定，不易消旋，R构型化合物较S构型化合物CXCR2拮抗活性更优。
　　代表性化合物2-34（CXCR2IC50=10nM，CXCR1/CXCR2选择性为910倍）在10μM浓度下对胰腺癌细胞株CFPAC1迁移抑制率为41％。同时，化合物2-34在模拟肠液和模拟胃液中稳定性良好，但在血浆（大鼠和人）和肝微粒体（大鼠、小鼠和人）中的不稳定性呈现种属差异。体外心脏毒性评价表明，化合物2-34对hERG离子通道无明显抑制作用。在体内生物利用度评价中，化合物2-34在大鼠中表现了较好的药代动力学性质，10mg/kg给药后，其Cmax、AUC0-t和t1/2分别为4499ng/mL、20742h·ng/mL和3.02h，生物利用度为90％。此外，通过分子模拟对接，预测了化合物2-34与CXCR2蛋白的结合模式，关键氨基酸残基Arg248、Tyr314和Ala249等均参与了分子-蛋白相互作用，该结合模式符合构效关系，可为分子的后续优化和评价提供指导。总之，基于药效团模型筛选优化得到的化合物2-34是一类结构新颖、高效、低毒、可口服的咪唑酮类选择性CXCR2拮抗剂，具有进一步开发的价值和成药前景。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

1 环丁烯二酮类选择性CXCR2拮抗剂的设计、合成和生物学评价

1．1 研究背景

1．2 含桥环环丁烯二酮类选择性CXCR2拮抗剂的发现

1．3 含桥环环丁烯二酮类化合物的合成

1．3．1 取代环丁烯二酮单甲醚／乙醚衍生物的制备

1．3．2 桥环胺类衍生物的制备

1．3．3 含桥环环丁烯二酮类目标分子的合成

1．4 含桥环环丁烯二酮类衍生物的生物学评价

1．4．1 含桥环环丁烯二酮类衍生物对CXCR2的拮抗活性及亚型选择性

1．4．2 化合物1-25对肺癌H1299细胞株的迁移抑制活性

1．4．3 化合物1-25对胰腺癌BXPC3细胞株的迁移抑制活性

1．4．4 化合物1-25对胰腺癌CFPACl细胞株的迁移抑制活性

1．4．5 化合物1-25的初步成药性评价

1．5 分子对接研究

1．6 小结

1．7 实验部分

1．7．1 化学合成

1．7．2 CXCR1／2拮抗活性测试

1．7．3 H1299细胞株细胞毒活性测试

1．7．4 H1299细胞株的划痕实验

1．7．5 BXPC3和CFPAC1细胞株细胞毒活性测试

1．7．6 BXPC3和CFPAC1细胞株的划痕实验

1．7．7 细胞迁移与侵袭(Transwell)实验

1．7．8 模拟肠液和模拟胃液稳定性测试

1．7．9 肝微粒体稳定性测试

1．7．10 血浆稳定性测试

1．7．11 大鼠体内初步药代动力学测试

1．7．12 计算机分子对接研究

2 咪唑酮类选择性CXCR2拮抗剂的设计、合成和生物学评价

2．1 研究背景

2．2 基于药效团模型的小型虚拟分子库筛选

2．2．1 HipHop模型的构建及验证

2．2．2 小型虚拟分子库的设计

2．2．3 基于药效团模型的虚拟筛选

2．3 三氮唑酮类以及三氮唑类化合物的合成

2．3．1 三氮唑酮类衍生物的合成

2．3．2 三氮唑类衍生物的合成

2．4 三氮唑酮类以及三氮唑类衍生物的体外生物学评价

2．4．1 三氮唑酮类以及三氮唑类衍生物对CXCR1／2拮抗活性

2．4．2 化合物2-12对H1299细胞株的细胞毒及迁移抑制活性

2．5 咪唑酮类选择性CXCR2拮抗剂的发现

2．5．1 咪唑酮类选择性CXCR2拮抗莉的设计

2．5．2 化合物2-13的优化方案

2．6 咪唑酮类化合物的合成

2．6．2 α-氨基酰胺的合成

2．6．3 咪唑酮类目标分子的合成

2．7 咪唑酮类衍生物的生物学评价

2．7．1 咪唑酮类衍生物对CXCR2拮抗活性及亚型选择性

2．7．2 化合物2-34对CFPAC1细胞株的迁移抑制活性

2．7．3 化合物2-34的初步成药性评价

2．8 化合物2-34的分子对接研究

2．9 小结

2．10 实验部分

2．10．1 化学合成

2．10．2 CXCR1／2拮抗活性测试

2．10．3 H1299细胞株细胞毒活性测试

2．10．4 H1299细胞株的划痕实验

2．10．5 CFPAC1细胞株细胞毒活性测试

2．10．6 CFPAC1细胞株的划痕实验

2．10．7 细胞迁移与侵袭(Transwell)实验

2．10．8 模拟肠液和模拟胃液稳定性测试

2．10．9 肝微粒体稳定性测试

2．10．10 血浆稳定性测试

2．10．11 hERG离子通道的抑制活性测试

2．10．12 大鼠体内生物利用度测试

2．10．13 计算机分子对接研究

参考文献

3 CXCR1／2与肿瘤转移的关系及其小分子拮抗剂的研究进展(综述)

3．1 简介

3．2 CXCR1／2的抗肿瘤转移前景

3．3 CXCR1／2拮抗剂的结构及类型

3．3．1 双芳基脲及其类似物

3．3．2 环丁烯二酮及其类似物

3．3．3 芳(杂)环酰胺衍生物

3．4 CXCR1和CXCR2通路尚需解决的问题及发展方向

3．4．1 CXCR2蛋白共晶结构的解析

3．4．2 探索抗肿瘤转移适应症的可行性

3．4．3 联合用药

3．5 总结

参考文献

作者简历