几种胶体微粒的毒性和炎症反应及其抑制方法研究

摘要

胶体微粒由于其独特的物理化学性质，在包括生物医学材料的众多研究领域正得到越来越多的关注。然而，在使用过程中胶体微粒对生物体的潜在危害也逐渐得到了重视。在胶体微粒投入使用前，对其进行全面的毒性评价，同时对无法避免的微粒所引起的毒性和炎症反应的消除或抑制，已经成为微粒研究中的一个重要方向。本文研究了三种不同表面修饰的纳米金刚石对骨髓间充质干细胞的细胞毒性和基因毒性，以及粒子被胞吞后对细胞分化潜能的影响;采用乳液交联法，制备了不同蛋白修饰的四种壳聚糖纳米微粒，研究其被RAW264.7巨噬细胞吞噬后所引起的炎症反应，及其在进入全血后所引起的免疫反应;研究了具有螯合金属离子或消耗细胞内活性氧作用的微粒对CuO纳米粒子和雾霾中PM2.5悬浮液毒性的抑制和消除作用。 纳米微粒的表面性质是影响其与细胞的相互作用的一个重要因素。采用三种不同表面修饰的纳米金刚石(NDs)，包括羧基修饰的(ND-COOH)、氨基修饰的(ND-NH3+)和聚乙二醇(PEG)修饰的(ND-PEG)纳米金刚石。对比了三种纳米金刚石与大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)作用的差异。结果表明，三种微粒在细胞培养环境中具有相似的聚集态尺寸(约100 nm)和表面电位(约为-10 mV)。三种粒子对MSCs细胞活性的影响呈现一定的浓度依赖性，不同表面修饰的纳米金刚石对MSCs的细胞毒性存在一定的差异。测定了细胞内部的活性氧水平，并通过碱性彗星实验研究了三种微粒的基因毒性。毒性分析的结果均表明，ND-NH3+的毒性高于ND-COOH和ND-PEG。三种纳米金刚石对MSCs的成骨分化无明显影响，但ND-COOH和ND-PEG能够一定程度上抑制MSCs的成脂分化。 胶体微粒在进入人体后，可能会引发免疫系统产生免疫反应，进而被清除;或引发一些炎症反应。通过乳化交联的方法制备了壳聚糖微粒(CS particles)，表面修饰不同种类和数量的人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)和卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，得到四种粒子，分别为CS@HSA-10、CS@HSA-57、CS@OVA-13和CS@OVA-65。将其与RAW264.7细胞和THP-1细胞共培养，发现表面蛋白修饰量相当时，CS@OVA的胞吞量大于CS@HSA，且引起更多的细胞炎症因子释放。与人全血共孵育不同的时间，发现全血中的中性粒细胞和单核细胞对CS@OVA的吞噬量要明显大于CS@HSA，引起的炎症因子的释放量也更大。血小板激活实验发现，CS@OVA会引起更多的血小板被激活。表面OVA的修饰会增强壳聚糖纳米微粒对巨噬细胞的炎症反应，以及在全血中的免疫反应，而HSA的修饰则引起较低的反应。 基于多种金属氧化物微粒的致毒机理通常与金属离子的产生相关，制备了不同氨基酸修饰的壳聚糖纳米微粒，分别为赖氨酸修饰(Ly-CS)、谷氨酸修饰(Glu-CS)和NaBH4处理（R-CS，作为对照），研究其对CuO纳米微粒毒性的抑制效果。水溶液中对Cu2+的螯合实验，证明三种微粒的螯合效果为Ly-CS＞Glu-CS＞R-CS。三种微粒在HepG2、A549和RAW264.7细胞中有相似的胞吞和胞吐。将三种壳聚糖微粒与CuO微粒和上述三种细胞共培养24 h，CuO纳米微粒的毒性得到了明显的抑制，且抑制效果(Ly-CS＞Glu-CS＞R-CS)与体外Cu2+离子的螯合能力一致。采用活性氧探针检测了细胞内的活性氧水平，发现三种微粒的加入能够明显降低三种细胞内CuO纳米微粒所引起的活性氧水平。说明壳聚糖纳米微粒能够通过螯合CuO释放的Cu2+，从而降低细胞内的ROS水平，达到抑制CuO纳米微粒的细胞毒性的效果。 智能响应型载体材料能够在响应环境刺激下实现装载物的控制释放。制备了ROS响应性的聚酮缩硫醇(PPADT)微粒，同时装载免疫抑制剂他克莫司(FK506)得到载药微粒（PPADT@FK506），研究上述微粒对三个不同地区的PM2.5悬浮液毒性的抑制作用。PPADT微粒具有良好的ROS响应性，装载了尼罗红(NR)的模型微粒PPADT@NR在与PM2.5和细胞共培养后，能够有效地释放尼罗红。将PPADT微粒与PM2.5悬浮液和A549、RAW264.7细胞共培养后，PM2.5悬浮液的毒性被基本消除，细胞内的活性氧水平得到了有效的消耗。对RAW264.7细胞分泌的炎症因子的检测结果，证实了PPADT@FK506微粒能够对PM2.5悬浮液的炎症反应进行有效地控制。动物实验结果也表明该载药微粒能够有效地实现对PM2.5引起的体内毒性和炎症反应的抑制。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述与课题提出

1．1 胶体徼粒概逑及其生物学应用

1．1．1 胶体微粒概述

1．1．2 无机胶体微粒

1．1．3 有机胶体微粒

1．1．4 胶体微粒在生物医学领域的应用

1．2 细胞对胶体微粒的胞吞

1．2．1 胞吞途径

1．2．2 影响胶体微粒胞吞的因素

1．2．3 微粒胞吞后对细胞功能的影响

1．3 胶体微粒的毒性

1．3．1 胶体微粒的毒性及毒性机制

1．3．2 毒性评价指标及检测方式

1．4 胶体微粒毒性的抑制

1．4．1 金属离子的螯合

1．4．2 活性氧水平的降低

1．4．3 免疫毒性的抑制

1．5 课题的提出

第二章 不同表面性质纳米金刚石对骨髓间充质干细胞的基因毒性影响

2．1 实验部分

2．1．1 主要原料与试剂

2．1．2 NDs的分散

2．1．3 NDs的性质表征

2．1．4 细胞实验

2．1．5 统计学分析

2．2 NDs的基本物理化学性质

2．3 不同表面修饰的NDs对MSCs的毒性和基因毒性

2．3．1 不同表面修饰的NDs对MSCs的毒性

2．3．2 不同表面修饰的NDs对MSCs的基因毒性

2．3．3 不同表面修饰的NDs对MSCs的活性氧水平的影响

2．3．4 MSCs对不同表面NDs的胞吞

2．4 不同表面修饰的NDs对MSCs分化潜能的影响

2．5 本章小结

第三章 不同白蛋白修饰的壳聚糖微粒的炎症反应及其在入全血中的免疫响应研究

3．1 实验部分

3．1．1 主要原料与试剂

3．1．2 壳聚糖粒子的制备

3．1．3 粒子表面HSA或OVA的修饰

3．1．4 CS@HSA和CS@OVA粒子的表征

3．1．5 细胞实验

3．1．6 四种壳聚糖粒子在全血中的免疫响应性

3．1．7 统计学分析

3．2 HSA和OVA修饰的CS粒子的制备与表征

3．2．1 粒子的形貌、大小和组成

3．2．2 粒子对全血凝血的影响

3．3 CS@HSA和CS@OVA粒子引起的炎症反应

3．3．1 细胞毒性和细胞胞吞

3．3．2 炎症因子的释放

3．4 CS@HSA和CS@OVA粒子在全血中的免疫响应性

3．4．1 血液中中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用

3．4．2 血液中炎症因子的释放

3．4．3 血液中血小板的激活

3．5 本章小结

第四章 不同氨基酸修饰的壳聚糖纳米粒子对CuO纳米微粒的毒性抑制

4．1 实验部分

4．1．1 主要原料与试剂

4．1．2 不同氨基酸修饰壳聚糖纳米粒子的制备

4．1．3 三种CS NPs的表征

4．1．4 细胞实验

4．2 三种CS NPs的基本物理化学性质

4．2．1 表面形貌、粒径和表面电位

4．2．2 表面蛋白吸附

4．2．3 溶液中Cu2+的吸附

4．3 三种CS NPs的毒性检测

4．4 细胞胞吞和胞吐

4．5 CS NPs对CuO纳米徼粒的毒性抑制

4．6 三种CS NPs对细胞内活性氧水平的抑制

4．7 本章小结

第五章 活性氧响应PPADT微粒载他克莫司对PM2．5 的毒性和炎症抑制研究

5．1 实验部分

5．1．1 主要原料与试剂

5．1．2 PM2．5 悬浮液的制备、表征及细胞毒性

5．1．3 PPADT微粒的制备

5．1．4 PPADT微粒的表征

5．1．5 细胞实验

5．1．6 动物实验

5．2 PM2．5 悬浮液的基本物理化学性质及细胞毒性

5．2．1 PM2．5 的形貌、粒径与表面电位

5．2．2 PM2．5 悬浮液的成分组成分析

5．2．3 PM2．5 悬浮液的细胞毒性

5．3 PPADT微粒的制备与表征

5．3．1 PPADT聚合物的合成与表征

5．3．2 PPADT微粒的基本物理化学性质

5．4 PPADT及载药微粒对PM2．5 悬浮液的毒性抑制

5．4．2 PPADT和PPADT@FK506微粒对PM2．5 的毒性抑制

5．4．3 PPADT和PPADT@FK506微粒对细胞内ROS水平的影响

5．5 PPADT@FK506微粒对PM2．5 炎症反应抑制

5．5．1 PPADT@NR微粒的胞内刺激释放

5．5．2 炎症因子释放的抑制

5．6 体内抑制效果

5．7 本章小结

全文总结

不足与展望

参考文献

作者简介