海参硫酸多糖对营养过剩诱发的代谢疾病调控机制研究

摘要

代谢综合征包括如肥胖、胰岛素抗性、血糖不耐受、高血脂等一系列症状，这些症状进一步恶化会造成代谢疾病的发生，如二型糖尿病、非酒精性脂肪肝等。近几年相关疾病致死率急速增长反映出环境和生活方式的改变，以高脂高糖为特征的现代社会饮食结构是促成代谢疾病高发的重要因素之一。因此，改善膳食结构，开发功能性食品成分，是预防和治疗代谢疾病的有效手段。多糖作为一种天然来源的无毒大分子物质，具有很高的生物活性，在控制代谢疾病方面有着独特的优势和功效。大多数多糖来源于植物，结构复杂难以鉴定，质量不易控制。海参硫酸多糖因其结构的高度重复性及其所蕴藏的巨大生物活性潜力，引发广大科研工作者的研究兴趣。近年来，有越来越多的研究表明，海参硫酸多糖能够调节机体能量代谢，缓解营养过剩带来的一系列的代谢疾病。海参硫酸多糖的结构具有很强的特异性，其生物活性取决于结构特异性。然而关于海参硫酸多糖结构与治疗代谢疾病之间的构效关系，目前还鲜有研究。
　　因此，本研究在前期研究基础上，选取了四种具有特异性结构的硫酸多糖作为研究对象，分别为美国肉参硫酸软骨素（fCS-Ib）、美国肉参岩藻聚糖硫酸酯(fuc-Ib)、菲律宾刺参硫酸软骨素(fCS-Pg)和菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯(fuc-Pg)。其中，fCS-Ib、 fuc-Ib和fCS-Pg的一级结构已经被解析，而fuc-Pg一级结构仍未知。本研究利用核磁、质谱等技术对fuc-Pg基本结构进行了进一步的解析。在已知四种海参硫酸多糖的基本结构基础上，对它们的高级结构进行解析。从分子量、硫酸根取代方式、空间结构等角度，在动物水平上研究了海参硫酸多糖结构对调节代谢疾病的功能活性的影响，并初步探究了其作用机制。主要研究内容有:
　　(1)菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯的一级结构解析
　　以菲律宾刺参岩藻聚糖为研究对象，采用温和酸降解法制备寡糖，利用质谱结合核磁技术对其结构进行了解析。结果表明酸特异性作用于海参岩藻聚糖中非硫酸化岩藻糖（单元D）和第二个2，4-sulfated岩藻糖（单元A）。分离纯化后得到一系列具有重复结构序列的硫酸寡糖，二级质谱结果表明菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯寡糖的结构符合[3Fuc(2S，4S)α1→3Fucα1→3Fuc(4S)α1→3Fucα1]n结构式。核磁共振结果进一步验证了这一重复结构单元。本研究发现fuc-Pg是一种新型岩藻聚糖硫酸酯。
　　(2)四种海参硫酸多糖高级结构解析及其对营养过剩引发高血脂的调节作用
　　基于前期研究和第一章结果，四种海参硫酸多糖的一级结构目前已经全部解析成功，但其高级结构即多糖链构象还未知，因此本章运用原子力显微镜(AFM)和光散射技术(SEC-MALLS)，进一步解析了四种海参硫酸多糖高级结构。在此基础上，对四种海参硫酸多糖的降血脂活性进行了研究。结果表明，多糖的侧链和硫酸根取代位点影响硫酸多糖的高级结构，具有岩藻糖侧链的fCS-Ib和fCS-Pg糖呈现无规则链状，具有4-O-Sulfated取代的fuc-Pg也呈现无规则链状结构，而以2-O-sulfated硫酸根取代为主的fuc-Ib则呈现球状。此外，链构象的不同造成了四种海参硫酸多糖的理化性质的不同，球状构象的fuc-Ib相对于直链构象的fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg，粘度更高。高脂膳食是最常见的营养过剩的膳食方式，能够造成肥胖、高血脂、炎症、肠道菌群紊乱等一系列代谢疾病。将四种硫酸多糖应用于以高脂饲料诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠模型中，结果表明，在相同剂量下，fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg相对于fuc-Ib具有更好的减肥、降血脂活性，能够降低血清甘油三酯和总胆固醇。fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg三种多糖中，fCS-Ib肝脏保护效果更佳。本研究表明硫酸根取代位点以及支链等一级结构会影响硫酸多糖在溶液中的高级结构，从而影响其降血脂活性。糖链在溶液中伸展开有利于硫酸多糖降血脂活性的发挥。
　　(3)美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对营养过剩引发的代谢疾病的影响
　　在前期实验的基础，本节选用降血脂、护肝效果最佳的美国肉参硫酸软骨素为研究对象，探究其对营养过剩引发代谢疾病的调控机制，从分子量角度研究了构效关系。以高脂高糖膳食喂养C57BL/6小鼠为模型，分别灌胃相同剂量的美国肉参硫酸软骨素和寡糖（DfCS-Ib）。结果表明，fCS-Ib及其降解产物都能够有效的抑制高脂膳食带来的代谢紊乱。在不影响摄食量的基础上，fCS-Ib和DfCS-Ib能够减少体重、肝脏、肾脏、脂肪组织的增加，降低血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(Glucose)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)的含量，提高血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的水平。同时，fCS-Ib和DfCS-Ib能够维持肝脏组织的正常形态，减少脂肪组织细胞肥大。此外，fCS-Ib和DfCS-Ib能够调节由营养过剩引起的脂肪组织中PPARγ，lcptin，aP2和F4/80的表达异常，维护脂肪组织的正常功能，促进脂肪因子的正常分泌，缓解高脂膳食引发的炎症。本节证明美国肉参硫酸软骨素及其寡糖能够缓解膳食引发的肥胖、高血脂、高血糖、炎症等代谢疾病。然而二者的作用靶向还不明确，有待于进一步研究。
　　(4)美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对营养过剩引发肠道菌群紊乱的影响
　　多糖一直被认为是一种膳食纤维，有利于肠道菌群的生长，本节利用16SrDNA技术，探究了美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对肠道菌群的影响，以验证二者的作用靶向目标。结果表明，本实验条件下的高脂膳食对肠道菌群的丰富度和多样性无明显影响，fCS-Ib和DfCS-Ib对肠道菌群的多样性无明显影响，但二者均能够提高肠道微生物丰富度。高脂膳食会改变粪便中微生物的种类和组成，造成肠道内的微生物菌群紊乱。fCS-Ib和DfCS-Ib则能够不同程度的缓解肠道菌群紊乱，提高有益菌Barnesiella的比例。相对于DfCS-Ib，大分子的fCS-Ib能够更有效的改善高脂膳食造成的肠道菌群紊乱，降低Firmicutes的丰度，提高Bacteroidetes的丰度，使二者的组成和比例更接近于正常组。DfCS-Ib能够改善高脂小鼠中Bacteroidetes门中有益菌的组成，但DfCS-Ib组中Erysipelotrichaceae丰度非常高，这一类型的微生物属于Firmicutes门，其对宿主的影响还有待确定。
　　(5)美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对营养过剩引发肝脏代谢紊乱的影响
　　营养过剩会引发肝脏代谢紊乱，从而造成机体能量不能正常代谢。本章运用转录组高通量测序手段检测美国肉参硫酸软骨素及其降解产物对营养过剩引发肝脏代谢紊乱的影响。相对于对照组，高脂组造成了不同代谢通路紊乱，尤其是糖脂代谢通路。fCS-Ib和DfCS-Ib则能够不同程度的缓解肝脏代谢紊乱。fCS-Ib和DfCS-Ib能够下调与脂质生成相关基因的表达，如Fasn，Acsl3，Acsl5，Elovl3，Elovl6，Scd1 and Scd2，同时上调与β氧化相关基因的表达，维持肝脏组织正常的生理代谢功能。与微生物结果不同的是，相对于fCS-Ib，小分子的DfCS-Ib能够更有效的改善高脂膳食造成的肝脏代谢紊乱，使其相关基因表达更接近于正常组。Rt-PCR进一步验证了本实验结果的准确性。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 海参硫酸多糖的结构及其功能活性研究现状

1．1．1 海参的研究概况

1．1．2 海参硫酸多糖的概况

1．2 膳食引发代谢疾病的研究概况

1．2．1 能量过剩引发肠道中的代谢疾病

1．2．2 肥胖

1．2．3 非酒精性脂肪肝

1．2．4 糖尿病

1．3 多糖对代谢疾病调控机制的研究进展

1．3．1 β葡聚糖对代谢疾病的调控作用

1．3．2 果胶对代谢疾病的调控作用

1．3．3 藻类岩藻聚糖硫酸醣对代谢疾病的调控作用

1．3．4 其他来源的多糖对代谢疾病的调控作用

1．4 本论文的立题背景、研究意义、研究内容和技术路线

1．4．1 立题背景和研究意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线图

第二章 菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯的一级结构解析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要仪器

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯的纯化

2．3．2 酸降解制备低分子量岩藻聚糖硫酸酯寡糖

2．3．3 ES-CID-MS初步鉴定菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯寡糖序列

2．3．4 ES-CID-MS／MS进一步分析寡糖组分序列

2．3．5 核磁解析菲律宾刺参岩藻聚糖硫酸酯结构

2．4 本章小结

第三章 四种海参硫酸多糖高级结构解析及其对营养过剩引发高血脂的调节作用

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要仪器与设备

3．2．3 海参硫酸多糖的提取、分离和纯化

3．2．4 原子力显微镜(AFM)

3．2．6 海参硫酸多糖的流交性

3．2．7 实验动物分组及喂养

3．2．8 大鼠血清及器官和组织样本获取

3．2．9 血清生化指标测定

3．2．10 数据统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 四种硫酸多糖的空间链构象

3．3．2 四种硫酸多糖的流变性

3．3．3 四种硫酸多糖的降血脂活性

3．3．3 四种硫酸多糖构效关系的探讨

3．4 结论

第四章 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对营养过剩引发的代谢疾病的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 主要仪器

4．2．3 美国肉参硫酸软骨素的提取、分离和纯化

4．2．4 美国肉参硫酸软骨素寡糖的制备

4．2．5 实验动物分组及喂养

4．2．6 血清及器官和组织样本获取

4．2．7 血清生化指标测定

4．2．8 组织切片及苏木精-尹红染色(H＆E染色)

4．2．9 脂肪组织基因表达的测定(Real-time PCR)

4．2．10 数据统计分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对小鼠体重以及脏器的影响

4．3．2 不同处理小鼠膳食摄入量

4．3．3 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对高脂膳食喂养小鼠血清指标的影响

4．3．4 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对高脂膳食喂养小鼠组织形态的影响。

4．3．5 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对高脂膳食喂养小鼠脂肪组织功能的影响

4．4 本章小结

第五章 美国肉参硫酸软骨素及寡糖对营养过剩引发肠道菌群紊乱的影响

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 主要仪器与设备

5．2．3 小鼠结肠内容物的获取

5．2．4 小鼠结肠内容物DNA的提取与质检

5．2．5 肠道菌群文库构建

5．2．4 数据统计分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 不同处理组微生物菌群测序原始数据统计及其优化

5．3．2 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对肠道菌群多样性的影响

5．3．3 OTU组成相似性分析

5．3．4 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖基于门水平对肠道菌群的影响

5．3．5 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖基于纲水平对肠道菌群的影响

5．3．6 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖基于目水平对肠道菌群的影响

5．3．7 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖基于科水平对肠道菌群的影响

5．3．9 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖基于属水平对肠道菌群的影响

5．3．10 LEfSe分析不同组之间肠道微生物表型

5．4 本章小结

第六章 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对营养过剩引发肝脏代谢紊乱的影响

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验材料

6．2．2 主要仪器与设备

6．2．3 转录组测序

6．2．5 数据分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 肝脏RNA质量检测

6．3．2 样本间相关性

6．3．3 不同处理组的转录本表达差异火山图

6．3．4 不同处理组的基因表达差异火山图

6．3．5 差异功能基因Gene Ontology分析

6．3．6 不同组差异基因的KEGG分析

6．3．7 美国肉参硫酸软骨素及其寡糖对糖脂代谢基因表达的影响

6．3．8 QRT-PCR法验证肝脏中部分基因表达情况

6．4 本章小结

7．1 全文总结

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

作者简介

在学期间取得的科研成果

致谢