海洋黑曲霉生料固态发酵产纤维素酶及酶的固定化研究

摘要

纤维素酶不是一种单一的生物酶，而是一个复合酶系，由多种酶组成。它在将纤维素原料水解成葡萄糖分子的过程中发挥着至关重要的作用。本文将在海洋黑曲霉产纤维素酶的液态发酵和固态发酵研究的基础上，重点研究生料固态发酵海洋黑曲霉产纤维素酶的过程，探索生料发酵的条件，并通过响应面法分析对培养条件进行了优化，之后还对该发酵方法进行了初步的放大试验，验证其可行性;最后对得到的纤维素酶进行固定化研究，研究内容以及取得的研究结果如下:
　　(1)对海洋黑曲霉生料固态发酵的培养条件进行了探索，得到了海洋黑曲霉生料发酵的基础培养基:麸皮为碳源，NH4Cl为氮源，KH2PO4为磷源。对培养条件进行单因素分析和响应面分析，得到了生料固态发酵产纤维素酶的最佳培养条件:麸皮20 g，玉米秸秆粉5 g、稻草粉5 g，NH4Cl0.8 g/L、FeSO40.01 g/L、KH2PO40.3 g/L，葡萄糖9.16 g/L，含盐度10％，种子液接种量34.89％、初始pH5.0，将培养基在30℃的恒温培养箱中培养5天。经过优化后发酵产物的滤纸酶活达到了12.29 U/g。
　　(2)将优化得到的培养条件应用于海洋黑曲霉生料固态发酵的放大试验研究中，单个浅盘的固态生料量是小试的30倍。首先，利用响应面优化得到生料培养基配方和培养条件，进行了初步的条件摸索，发现在规模放大后，其发酵周期略有延长，在发酵第7天酶活才达到最高，所得最高酶活为9.05 U/g。之后对发酵温度、空气湿度、翻料方式、堆料厚度等因素进行单因素分析，发现通过多次翻料搅拌，提高前期发酵温度至35℃，减少堆料厚度至4 cm，将空气湿度固定在65％，可以有效抑制杂菌污染，提高了黑曲霉生料固态发酵的产纤维素酶的酶活。
　　(3)研究了纤维素酶的固定化方法，选取海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖为载体，制备了固定化纤维素酶，对三种固定化酶的羧甲基纤维素酶酶活(CMC)进行了比较，发现CMC酶活最高的是海藻酸钠固定化酶。之后对固定化酶制备过程中的多个因素进行分析，得到海藻酸钠固定纤维素酶的最优条件是，在pH为5的粗酶液中加入40 mg/mL的海藻酸钠，交联剂戊二醛浓度为0.3％，固定化时间为8h。
　　上述这些工作，尤其是生料的应用，为简化海洋黑曲霉发酵生产纤维素酶生产工艺、提高纤维素酶酶活，提供了又一条有效途径，也为工程化生产纤维素酶提供了重要的数据和方法。

目录

声明

致谢

摘要

1．1 生物质能源概述

1．1．1 纤维素的结构

1．1．2 纤维素的水解

1．2 纤维素酶的研究

1．2．1 纤维素酶

1．2．2 纤维素酶的组成

1．2．3 纤维素酶的分子结构与功能

1．2．4 纤维素酶的作用机制

1．2．5 纤维素酶的来源

1．2．6 纤维素酶的应用

1．3 纤维素酶的发酵工艺

1．4 生料发酵

1．4．1 生料发酵在酿酒中的应用

1．4．2 生料发酵在酿醋中的应用

1．4．3 生料发酵在饲料中的应用

1．5 酶的固定化研究

1．5．1 酶的固定化方法

1．5．2 固定化载体

1．6 海洋黑曲霉产纤维素酶的研究

1．7 本文的研究思路与内容

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 发酵菌株

2．2．2 原料与试剂

2．2．3 仪器与设备

2．2．4 试剂配制

2．2．5 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 接种与培养

2．3．2 纤维素粗酶液的提取

2．3．3 发酵料曲含水量的测定

2．3．4 葡萄糖标准曲线的制作

2．3．5 纤维素酶滤纸酶活的测定

2．4 实验设计

2．4．1 单因素分析

2．4．2 多因素PB试验设计

2．4．3 最陡爬坡试验设计

2．4．4 中心组合设计

2．5 实验结果与分析

2．5．1 单因素分析

2．5．2 多因素PB试验结果分析

2．5．3 最陡爬坡试验结果

2．5．4 中心组合实验结果

2．6 本章小结

3．1 引言

3．2 材料与试剂

3．2．1 发酵菌种

3．2．2 主要仪器与设备

3．2．3 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 种子液制备

3．3．2 生料固态发酵

3．4 实验结果与分析

3．4．1 发酵时间对酶活的影响

3．4．2 搅拌对发酵效果的影响

3．4．3 培养基厚度对酶活的影响

3．4．4 培养箱空气湿度对酶活的影响

3．4．5 多段温度发酵对酶活的影响

3．5 本章小结

4．1 引言

4．1 实验试剂

4．3 实验方法

4．3．1 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液的配制

4．3．2 海藻酸钠固定化纤维素酶的制备

4．3．3 壳聚糖固定化纤维素酶的制备

4．3．4 琼脂糖固定化纤维素酶的制备

4．3．5 游离纤维素酶和固定化纤维素酶的酶活力测定

4．4 实验结果与分析

4．4．2 载体制备条件对固定化酶活的影响

4．4．3 固定化酶的最适pH的变化

4．4．4 固定化酶的最适反应温度的变化

4．4．5 固定化酶的重复使用性

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简介

在学期间所取得的科研成果