异丙醇脱氢酶固定化工艺研究

摘要

NADH主要存在于线粒体中，是细胞进行代谢核心物质。作为一种药物，NADH有清除机体自由基、预防癌症、治疗癌症、治疗神经退行性疾病等功能。它既是一种药品，也是一种保健品，有广阔市场。本实验通过固定化实验室异丙醇脱氢酶工程菌株所产酶，并对其固定化工艺、催化反应过程进行优化，为其生产应用奠定基础。
　　粗酶液制备。选取最优发酵条件，摇瓶装液量40mL，诱导剂终浓度0.8mM，诱导剂加入时机在菌体OD600到0.6左右时加入，诱导表达时间12h。在300W超声条件下，悬菌液浓度0.15g/mL，破碎时间10min可使粗酶液酶活力达到最大。
　　固定化载体初筛。通过吸附、包埋、交联、全细胞固定化等方法对异丙醇脱氢酶或者工程菌细胞进行固定化。在各类树脂、凝胶颗粒等20多种载体中，经过初筛得到酶活保留率为68.3％的载体ESR-3。
　　固定化过程优化。初筛得到载体固定化过程进行优化，最终使ESR-3载体固定化异丙醇脱氢酶酶活保留率达到78.3％。固定化异丙醇脱氢酶最优条件为:固定化时间2h，缓冲液pH为7，摇床转速150r/min，固定化温度20℃。
　　固定化异丙醇脱氢酶酶学性质初探。固定化酶最适宜反应温度为30℃，游离态酶最适宜反应温度为35℃，固定化酶的热稳定性有所下降。固定化酶和游离态酶最适宜反应pH均为9，固定化酶耐酸、耐碱能力明显提高。储存稳定性好，4℃保存28天仍有89.7％酶活性，而游离态酶已经降至67％。固定化酶重复使用8次酶活衰减至一半，且将反应等比例放大7倍至210mL后，反应10h得到产物345mg，转化率70.4％。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 生物催化简介

1．1 发酵

1．2 NADH简介

1．3．1 NADH研究历史

1．3．2 NAD的理化性质

1．3．3 NADH的应用

1．3．4 NADH的生产方法

1．3．5 NADH国内国际市场

1．4 固定化酶

1．4．1 固定化酶定义

1．4．2 固定化酶载体的选择

1．4．3 固定化酶方法的选择

1．4．4 不同固定化方法的选择与比较

1．4．5 固定化前后性质比较

1．5 研究目的与主要的研究内容

1．5．1 研究目的

1．5．2 主要研究内容

第2章 粗酶液制备以及酶活测定方法的建立

1．1 引言

2．2 实验仪器和材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要实验材料和试剂

2．2．3 实验方法

2．2．4 酶活测定方法的建立及固定化过程的验证

2．2．5 大肠杆菌摇瓶发酵和粗酶液提取

2．3 本章小结

第3章 固定化载体的筛选

3．1 引言

3．2．1 主要实验仪器

3．2．2 研究中用到的主要试剂和材料

3．3 载体的筛选

3．3．1 酶活保留率定义

3．3．2 大孔树脂吸附固定化酶

3．3．3 环氧基树脂交联固定化酶

3．3．4 氨基类载体交联固定化酶

3．3．5 氨基类树脂吸附交联固定化酶

3．3．6 凝胶小球包埋

3．3．7 凝胶小球交联

3．3．8 全细胞的固定化

3．3．9 氨基类载体直接交联与吸附交联固定化酶对比

．分析与讨论

3．5 本章小结

第4章 ESR-3载体固定化过程优化

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 主要实验仪器

4．2．2 实验材料和试剂

4．3 实验结果和分析

4．3．1 粗酶液浓度对固定化过程影响

4．3．2 固定化时间对固定化过程影响

4．3．3 固定化缓冲液pH对固定化过程的影响

4．3．4 固定化转速对固定化过程影响

4．3．5 固定化温度对固定化过程影响

4．4 本章小结

第5章 固定化酶酶学性质探究

5．1 绪论

5．2 主要实验仪器和实验材料

5．2．1 主要实验仪器

5．2．2 主要实验材料

5．3 实验方法以及实验结果

5．3．1 固定化酶的最适宜pH

5．3．2 固定化酶的pH稳定性

5．3．3 固定化酶的最适宜温度

5．3．4 固定化酶的温度稳定性

5．3．5 固定化酶的储存稳定性

5．3．6 固定化酶的醇耐受性

5．3．7 重复使用次数

5．3．8 水洗次数对固定化酶酶活力的影响

5．3．9 固定化前后动力学常数比较

5．4 固定化酶催化反应的放大

5．5 本章小结

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢