2，3，6-三甲基苯酚一步合成2，3，5-三甲基氢醌氧化还原酶的挖掘和分子改造

摘要

2，3，5-三甲基氢醌（TMHQ）是人工合成维生素E的重要前体，维生素E作为目前市场容量最大的维生素产品之一，在医药、饲料、化妆品等方面有着广泛的应用。2，3，6-三甲基苯酚（TMP）氧化还原法和异佛尔酮法是工业合成2，3，5-三甲基氢醌的主要方法，但是化学法普遍存在反应步骤多，反应条件苛刻，催化剂及溶剂的使用对环境造成污染等问题，而生物催化法具有反应条件温和、绿色清洁等优点。为此，本课题通过构建氧化还原酶库，从中筛选出能够一步催化TMP生成TMHQ的生物催化剂，并在此基础上通过优化反应条件和定向进化的方法提高其催化活性。
　　通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行基因挖掘，克隆了来源于不同物种的氧化还原酶并构建E.coli BL21(DE3)重组菌进行诱导表达，通过调整诱导温度、诱导时间和分子伴侣等进行表达优化，最终获得6个可溶性表达的蛋白，成功构建了氧化还原酶库;在此基础上，以2，3，6-三甲基苯酚（TMP）为底物，NADH为氢供体，筛选能够合成2，3，5-三甲基氢醌(TMHQ)的目标蛋白，最终获得4个具有目标催化活性的重组酶，即来自于大肠杆菌的HapC和UbiH-K、来自枯草芽孢杆菌的yjiB和来自巨大芽孢杆菌的P450BM3，其中以P450BM3的催化活性最佳。
　　在确认P450BM3对2，3，6-三甲基苯酚的催化活性后，从辅酶特异性、温度、pH、底物浓度、助溶剂及助溶剂浓度和金属离子等七个方面对反应体系进行了优化。结果表明，底物浓度为0.5 mM时，P450BM3能利用NADH和NADPH两种辅酶进行催化反应，反应最佳温度为25℃，最适pH为7.0，最适助溶剂为丙酮，助溶剂溶度为5％，金属离子Fe2+能促进反应进行;经过一系列反应条件的优化，P450BM3催化TMP生成TMHQ的产物得率由最初的0.4％提高到3.19％，提高了近7倍。
　　为了进一步提高P450BM3一步催化TMP生成TMHQ的催化活性，采用定向进化的手段对酶进行改造。结合P450BM3晶体结构和文献报道催化非天然底物的分子改造经验，运用定点饱和突变的方法构建突变体文库，利用咪唑蓝/吩嗪硫酸甲酯（MTT/PMS）显色的高通量筛选方法，获得活性分别提高57.5％和71.9％的两株突变体I259P和L181Q。动力学参数分析表明，两个突变体的Km值相比野生型均有所下降，对底物更具亲和力，总催化活性（kcat/Km）也均高于野生型。分子对接结果表明，L181Q的突变有利于关键氨基酸间氢键的形成从而稳定催化中心，促进反应进行，I259P位点突变则改变了底物通道内氨基酸残基与底物的相互作用，使底物分子更接近催化中心Fe原子。
　　研究结果表明，生物催化剂代替化学法合成药物中间体具有一定的可行性，本研究中成功筛选到能够一步催化TMP合成TMHQ的生物催化剂，为生物合成TMHQ奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写词对应表

1 绪论

1．2．1 2，3，6-三甲基苯酚(TMP)氧化还原法

1．2．2 异佛尔酮法

1．2．3 TMHQ的生物合成

1．3 氧化还原酶

1．3．1 氧化还原酶简介

1．3．2 过氧化物酶

1．3．3 单加氧酶

1．4 酶分子改造

1．4．1 定向进化

1．4．2 半理性设计

1．4．3 理性设计

1．5 本课题研究的意义及内容

2 氧化还原酶库的构建及筛选

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 菌株及质粒

2．2．2 试剂与工具酶

2．2．3 实验仪器设备

2．2．4 氧化还原酶的挖掘

2．2．4 基因组的提取

2．2．5 大肠杆菌感受态的制备

2．2．6 目的基因的扩增及重组质粒的构建

2．2．7 重组子的鉴定

2．2．8 目标蛋白的表达

2．2．9 SDS-PAGE检测蛋白表达

2．2．10 氧化还原酶活性筛选

2．2．11 HRP C的复性

2．2．12 HRP C酶活检测

2．2．13 液相检测条件

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 目的基因的克隆

2．3．2 目标蛋白的可溶性表达

2．3．3 氧化还原酶催化TMP活力筛选

2．4 本章小结

3 P450BM3催化2，3，6-三甲基苯酚氧化的反应条件优化

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种

3．2．2 试剂

3．2．3 仪器

3．3 实验方法

3．3．1 P450BM3重组蛋白的诱导表达

3．3．2 目标蛋白的纯化

3．3．3 蛋白浓度的测定

3．3．4 还原剂的选择

3．3．5 催化反应的条件优化

3．2．6 反应进程

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 检测条件的优化

3．3．2 还原剂对TMHQ氧化反应的影响

3．3．3 辅酶对催化反应的影响

3．3．4 温度对催化反应的影响

3．3．5 pH对催化反应的影响

3．3．6 助溶剂对催化反应的影响

3．3．7 助溶剂浓度对催化反应的影响

3．3．8 底物浓度对催化反应的影响

3．3．9 金属离子对催化反应的影响

3．3．10 P450BM3催化TMP生成TMHQ的反应进程

3．4 本章小结

4 氧化还原酶P450BM3在大肠杆菌中的定向进化

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株

4．2．2 试剂、试剂盒、工具酶

4．2．3 实验仪器设备

4．3 实验方法

4．3．1 突变文库的构建

4．3．2 突变文库的诱导表达

4．3．3 高通量筛选方法的构建

4．3．4 复筛

4．3．5 突变体蛋白的表达与纯化

4．3．6 动力学常数测定

4．3．7 分子对接

4．4 结果与讨论

4．4．1 突变文库的构建

4．4．2 高通量筛选方法构建

4．4．3 突变体蛋白的表达

4．4．4 P450BM3和突变体催化TMP生成TMHQ

4．4．5 分子对接

4．5 本章小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录