木糖醇对牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预及其应用研究

摘要

目的：
　　金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的防治较为困难。本试验在分析杭州地区奶牛场奶样、鼻拭子样及直肠拭子样中金黄色葡萄球菌的分离率、耐药性及其生物被膜形成能力基础上，研究不同浓度木糖醇对生物被膜形成的干预及临床治疗效果，旨在为生物被膜金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎防治提供新思路。
　　方法与结果：
　　(1)通过金黄色葡萄球菌显色培养基、触酶试验、血凝试验、生化试验及PCR等手段，金黄色葡萄球菌的检出率高达60.7％(236/389)，其中奶样占比56.7％(152/268)，鼻拭子样中检出率为71.2％(47/66)，直肠拭子样中检出率为67.3％(37/55)。
　　(2)采用CLSI标准，应用K-B法测定临床分离株对18种常用抗菌药物的耐药性，结果显示，对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、奥格门汀、四环素表现出很高的耐药性，耐药率分别为99.58％(235/236)、98.73％(233/236)、98.31％(232/236)、82.63％(195/236)、74.58％(176/236)、70.34％(166/236);其中奶样中金黄色葡萄球菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、奥格门汀、四环素表现出较高的耐药率，耐药率分别为99.34％(151/152)、99.34％(151/152)、99.34％(151/152)、74.34％(113/152)、72.37％(110/152);鼻拭子样中金黄色葡萄球菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、奥格门汀、头孢曲松表现出较高的耐药率，耐药率分别为100.00％(47/47)、100.00％(47/47)、97.87％(46/47)、95.74％(45/47)、95.74％(45/47);直肠拭子样中金黄色葡萄球菌对青霉素、奥格门汀、阿莫西林、氨苄西林、四环素表现出较高的耐药率，耐药率分别为100.00％(37/37)、100.00％(37/37)、94.59％(35/37)、94.59％(35/37)、94.59％(35/37)。
　　进一步耐药谱分析表明，236株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌受试菌均表现为多重耐药;其中奶样中对2-4种耐药的有10株，对5-7种耐药的有86株，对8-10耐药的有53株，对11-12种耐药的有3株;鼻拭子样中对4种耐药的有1株，对5-7种耐药的有21株，对8-10耐药的有24株，对11种耐药的有1株;直肠拭子样中对5-7种耐药的有9株，对8-10耐药的有28株。
　　(3)通过刚果红平板试验、96孔板法和置片法对分离菌进行了生物被膜形成能力研究。刚果红平板试验定性检测发现，有74.6％(176/236)能形成生物被膜;其中奶样中有78.95％(120/152)能形成生物被膜;鼻拭子样有100.00％((47/47)能形成生物被膜;直肠拭子样中有24.32％(9/37)能形成生物被膜。通过96孔板法定量检测发现，在236个样品中，均能形成生物被膜，其中奶样中生物被膜形成能力强、中和弱依次为40、92和20，分别占比26.32％、60.53％和13.16％;鼻拭子样中生物被膜形成能力强、中和弱依次为31、7和9，分别占比65.96％、14.89％和19.15％;直肠拭子样中生物被膜形成能力强、中和弱依次为11、21和5，分别占比34.75％、50.85％和14.41％。以盖玻片作为载体片，培养4天后可得成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜。
　　(4)随机选取标准菌株ATCC29213和9株分离株（生物被膜形成能力强、中、弱各3株），通过置片法并结合平板计数法分析不同浓度木糖醇对生物被膜形成的干预，结果发现，与不用木糖醇(2.28×105)相比，经12.5％、25％、50％的木糖醇处理后粘附到盖玻片上的菌落数（分别为1.51×105、1.37×105、1.10×105）分别降低了33.8％，39.9％和51.8％，差异均极显著(P＜0.01)，提示木糖醇可以有效抑制金黄色葡萄球菌的粘附。
　　(5)采用不同浓度（5％、10％、20％和50％）的木糖醇与头孢噻呋联合对奶牛乳房炎（主要是隐性乳房炎）进行治疗，通过测定pH值、细菌数量、细菌生物被膜形成能力等来评价疗效，同时也探索了木糖醇与头孢噻呋的体外抗菌和抗粘附作用，结果发现，5％、10％、20％和50％的木糖醇均对奶牛乳房炎有效，其中5％木糖醇与头孢噻呋联用的有效率高达90％，达到同样的抑菌效果，木糖醇可减少头孢噻呋的使用量。
　　结论：
　　杭州地区不同规模奶牛场中金黄色葡萄球菌的分离率高达60.7％，其中奶样占比56.7％，鼻拭子样中检出率为71.2％，直肠拭子样中检出率为67.3％，是引起杭州地区奶牛乳房炎的主要病原菌之一，具有很强的耐药性，且多重耐药严重，普遍能够形成生物被膜，0.125g/mL-0.5g/mL木糖醇对该菌有抗粘附作用，5％木糖醇可辅助头孢噻呋更好地控制奶牛乳房炎。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 奶牛乳房炎

2 金黄色葡萄球菌

3 金黄色葡萄球菌生物被膜与奶牛乳房炎

4 展望

参考文献

第二章 木糖醇对人源、动物源常见病原菌的抗菌作用

1 木糖醇对人源常见病原菌的抗菌作用

2 木糖醇对动物源常见病原菌的抗菌作用

3 展望

参考文献

第二部分 试验研究

第一章 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 金黄色葡萄球菌耐药性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力分析

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第四章 木糖醇的抗粘附作用

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第五章 木糖醇辅助用于奶牛乳房炎治疗的应用研究

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

本文主要结果、结论与展望

附录

致谢