S1PR3在细菌性脓毒症发生发展中的作用及机制研究

摘要

本文主要分为以下几个部分: 第一部分S1PR3与细菌性脓毒症发生发展的关系 目的： 1-磷酸鞘氨醇受体3(Sphingosine1-phosphate receptor3，S1PR3)是七次跨膜G蛋白(G protien)偶联受体家族的其中一员，它的主要功能是与磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate，S1P)相结合，从而启动了细胞跨膜信号转导，调节细胞增殖，血管生成和炎症反应。现在，对于S1PR3调控外周固有免疫细胞及中枢固有免疫细胞的研究较为普遍，主要是集中在促炎反应方面，而在病原微生物清除中的机尚未可知。为此，该部分实验主要集中在检测S1PR3在各类脓毒症模型中的表达及其与脓毒症发生发展的相关性。 方法： 利用骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)建立体外脓毒症模型，定量PCR检测S1PR3表达水平变化。应用盲肠结扎穿孔(cecum ligation and puncture，CLP)，制作WT（Slpr3+/+）、Slpr3+/-及Slpr3-/-三种基因型小鼠脓毒症模型，观察脓毒症小鼠在手术后10d的生存率;手术后72h应用琼脂平板培养法分别检测血液标本、腹腔灌洗液标本及重要实体器官的细菌负荷量;应用腹腔内针筒定量注射E.coli，从而制备WT、Slpr3+/-及Slpr3-/-三种基因型的脓毒症小鼠腹腔直接感染模型，监测小鼠模型48h后的生存率;分别于模型后24h，采用琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。 结果： LPS和热灭活的E.coli刺激后，BMDM的S1PR3表达水平均显著高于生理盐水组（**P＜0.01）。CLP模型后，WT小鼠的腹腔巨噬细胞S1PR3表达水平显著高于假手术组（第1天：*P＜0.05，第3天：**P＜0.01）和静息状态的腹腔巨噬细胞（第1天：**P＜0.01，第3天：**P＜0.001）。E.coli腹腔感染诱导脓毒症模型后，WT小鼠的腹腔巨噬细胞S1PR3表达水平显著高于假手术组（**P＜0.001）和未处理的腹腔巨噬细胞（**P＜0.001）。CLP模型后，Slpr3-/-小鼠的10d生存率(20.0％)显著低于WT小鼠(76.2％)和Slpr3+/-小鼠(79.2％)（***P＜0.001），Slpr3-/-脓毒症小鼠血液标本、腹腔灌洗液标本、肺脏组织、脾脏组织及肝脏组织细菌负荷量较WT脓毒症小鼠明显升高。E.coli腹腔感染诱导脓毒症模型后，Slpr3-/-小鼠的48h生存率(15.4％)显著低于WT小鼠(47.8％)和Slpr3+/-小鼠(52.9％)（*P＜0.05），Slpr3-/-小鼠腹腔灌洗液细菌负荷较WT小鼠显著升高（**P＜0.01）。MRSA腹腔感染诱导脓毒症模型后，Slpr3-/-小鼠的48h生存率(15.4％)显著低于WT小鼠(47.8％)和Slpr3+/-小鼠(52.9％)（*P＜0.05），Slpr3-/-小鼠腹腔灌洗液细菌负荷较WT小鼠显著升高（*P＜0.05）。 结论： S1PR3在脓毒症发生发展中具有重要作用;S1PR3缺失导致病原体清除能力和脓毒症模型小鼠生存率下降;S1PR3对宿主具有保护作用。 第二部分 S1PR3对巨噬细胞杀菌活性的影响 目的: 考虑到S1PR3缺失的脓毒症小鼠与WT脓毒症小鼠相比，细菌负荷量升高，免疫力及低抗力下降，脓毒症小鼠的死亡率上升。因此，有必要明确哪一类免疫细胞的S1PR3缺失有着这样的作用。 方法: 首先，制作四种成熟的骨髓移植嵌合体模型:Slpr3-/-→ Slpr3-/-，WT→WT,Slpr3-/→WT，和WT→ Slpr3-/-，建成模型后腹腔定量注射E.coli，观察感染后四种嵌合体模型小鼠48 h生存率，并在感染24 h后，琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。构建表达S1PR3的重组腺病毒和对照腺病毒，分别感染BMDM。高表达S1PR3的BMDM于脓毒症模型诱导后立即回输至小鼠体内，观察重组S1PR3对脓毒症小鼠48h生存率的影响，另外在感染24 h后，琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液细菌负荷。S1PR3激动剂于CLP模型后0.5h注射至小鼠体内，观察实验组和对照组48h生存率。S1PR3激动剂于腹腔感染E.coli诱导脓毒症模型后0.5h、3h及6h注射至小鼠体内，观察实验组和对照组48h生存率，并在E.coli感染3h和6h后，琼脂平板培养法检测腹腔灌洗液、肺脏、脾脏和肝脏细菌负荷。 结果: E.coli腹腔感染模型后，WT→S1pr3-/-组48h生存率(33.3％)显著高于Slpr3-/-→ Slpr3-/-组（0.0％，*P＜0.05），WT→Slpr3-/-组24h腹腔灌洗液的细菌负荷显著低于Slpr3-/-→ Slpr3-/-组（*P＜0.05）;Slpr3-/-→WT组48h生存率(20.0％)显著低于WT→WT组（50.0％，*P＜0.05），Slpr3-/-→WT组24h腹腔灌洗液的细菌负荷显著高于WT→WT组（*P＜0.05）。腺病毒高表达巨噬细胞S1PR3后建立脓毒症模型，回输高表达S1PR3的BMDM的小鼠48h生存率(85.71％)显著高于对照组（50.0％，*P＜0.05），回输高表达S1PR3的BMDM的小鼠的细菌清除能力也显著高于对照组（*P＜0.05）。S1PR3激动剂于CLP模型后0.5h注射至小鼠体内，实验组48h生存率显著高于对照组（*P＜0.05）。S1PR3激动剂于腹腔感染E.coli诱导脓毒症模型后0.5h、3h及6h注射至小鼠体内，实验组48h生存率均显著高于对照组（*P＜0.05，**P＜0.01），WT小鼠腹腔灌洗液、血液、肺、脾和肝的细菌负荷均显著低于对照组（*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001）。体外吞噬实验，Slpr3-/-小鼠BMDM与WT小鼠BMDM的吞噬能力在15min、30min、60min和120min时均无显著差异，Slpr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞与WT小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力在15min、30min、60min和120min时无显著差异;体外杀菌实验（庆大霉素保护实验），Slpr3-/-小鼠BMDM的存活细菌数在3h和6h均显著高于WT小鼠BMDM（*P＜0.05），Slpr3-/-小鼠腹腔巨噬细胞的存活细菌数在3h和6h均显著高于WT小鼠腹腔巨噬细胞（*P＜0.05，**P＜0.01），S1PR3激动剂处理后WT小鼠腹腔巨噬细胞的存活细菌数在3h和6h显著低于对照组（*P＜0.05，**P＜0.01）。 结论: S1PR3通过巨噬细胞的杀菌能力，而非吞噬能力来发挥抗菌能力;提高内源性S1PR3活性有利于提高巨噬细胞细菌清除能力，在小鼠感染中发挥保护作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分S1PR3与细菌性脓毒症发生发展的关系

1材料和方法

2结果

3讨论

4 小结

参考文献

第二部分S1PR3对巨噬细胞杀菌活性的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

4 小结

参考文献

第三部分S1PR3促进巨噬细胞杀菌功能的分子机制

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第四部分单核巨噬细胞S1PR3的表达与脓毒症预后的关系

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

综述 S1PRs的免疫调节功能研究进展

作者简介及博士在读期间发表论文