EGCG、葡萄籽原花青素与二氢杨梅素协同抗氧化及对小鼠乳腺癌4T1细胞的协同抑制作用研究

摘要

随着自由基生命科学研究的快速发展以及人们对氧自由基和疾病关系研究的不断深入，抗氧化剂被应用到食品、保健食品、日用品、化妆品等各个领域。天然产物抗氧化剂安全低毒，且普遍具有抗炎、预防心脑血管疾病、抗菌、抗肿瘤作用等多种生物活性，已成为当前全球范围内研究热点之一。其中，EGCG、葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidins，GSP)、二氢杨梅素(Dihydromyricel，DMY)等都是备受关注的天然产物抗氧化剂。研究发现，多种抗氧化功效因子联合使用比单一组分有更好的效果，即呈现协同作用。本文系统地研究了EGCG、GSP、DMY这三种天然产物在抗氧化、抑制糖尿病相关酶活性以及抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖方面的协同作用，以期为日常膳食指导以及相关产品开发提供依据。主要研究结果如下: 1.选用DPPH、ABTS、羟基自由基三种体外抗氧化模型测定EGCG、GSP和DMY单种物质以及不同比例复配物的抗氧化作用，并采用等辐射分析法对三者的抗氧化相互作用效果进行评价。三种天然产物的抗氧化能力随浓度增大而增强，抗氧化能力从高到低依次为EGCG＞DMY＞GSP，在三种抗氧化体系下，抗氧化能力排序相同。三种天然产物的复配物呈现最佳抗氧化协同作用的配方依次为:DPPH自由基清除实验中EGCG∶GSP∶DMY=4.8∶1.2∶4的组合(协同率为29.28％); ABTS自由基清除实验中EGCG∶GSP∶DMY=4.8∶1.2∶4的组合（协同率为15.42％）;羟基自由基清除实验中EGCG∶GSP∶DMY=4∶4∶2的组合(协同率为55.69％)。 2.测定了EGCG、GSP和DMY单种物质及其不同比例复配物对三种糖尿病相关酶活性的抑制作用，三种糖尿病相关酶分别为α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶以及DPP-Ⅳ酶。三种天然产物对α-淀粉酶活性的抑制能力从大到小依次为EGCG＞GSP＞DMY，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用为GSP＞EGCG＞DMY，对DPP-Ⅳ酶活性的抑制能力为EGCG＞GSP＞DMY，三种天然产物在不同的酶体系中表现出不同的抑制能力。研究不同比例复配物对三种糖尿病相关酶活性的抑制作用，发现三种天然产物复配时，呈现一定的协同增效作用。在α-淀粉酶抑制实验中，三种物质组合协同效果最佳的组合为EGCG∶GSP∶DMY=4∶1∶5，协同率为25.95％。抑制α-葡萄糖苷酶协同效应最佳的组合是EGCG∶GSP∶DMY=3.2∶4.8∶2，协同率为27.69％。在DPP-Ⅳ酶抑制实验中，EGCG∶GSP∶DMY=1.6∶6.4∶2的组合表现出最佳的协同增效作用，协同率为66.65％。 3.采用小鼠乳腺癌4T1细胞作为评价物，评价协同作用的EGCG、GSP、DMY复配物的抗肿瘤活性，进一步探究三种天然产物的协同作用。实验发现这三种天然产物都具有一定的抑制4T1细胞增殖和促进4T1细胞凋亡的作用。其中DMY抑制4T1细胞增殖的能力最强（IC50=20.05±1.66μg/mL）。将三种天然产物按照不同比例制成复配物，测定复配物对4T1细胞增殖的抑制作用。两两复配时，对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖抑制协同作用最强的组合比例分别为:EGCG∶GSP=6∶4，协同率为61.10％; EGCG∶DMY=2∶8，协同率为22.64％;GSP∶DMY=6∶4，协同率为57.10％。当三种天然产物组合时，不同配比都显示出良好的协同增效作用，其中协同率最高的组合为EGCG∶GSP∶DMY=2.4∶1.6∶6，协同率为63.99％。 4.筛选出对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖抑制协同作用最强的组合，即EGCG-GSP(6∶4)、EGCG-DMY(2∶8)、GSP-DMY(6∶4)、EGCG-GSP-DMY(2.4∶1.6∶6)四组天然产物复配物，探究其对小鼠乳腺癌4T1细胞的协同抑制效应与机制。发现四组天然产物复配物都能一定程度地阻滞细胞周期，使4T1细胞凋亡率升高，且复配物组合的促凋亡作用效果优于几种天然产物单独作用的效果。四组天然产物复配物都可以使4T1细胞内ROS水平显著增加(p＜0.05)，且EGCG-GSP-DMY(2.4∶1.6∶6)组合的作用效果优于三种物质单独作用或者两两复配物的作用效果。小鼠乳腺癌4T1细胞在各组合天然产物复配物的作用下，caspase9和caspase3活性都有所增加，提示诱导凋亡是个组合天然产物复配物抑制4T1细胞生长与增殖的重要途径。各组天然产物的复配物可影响4T1细胞内NO的释放水平，对NO释放水平的影响可能会促进4T1细胞凋亡、抑制4T1细胞生长。

目录

声明

致谢

摘要

术语与缩略语

图表索引

第一章文献综述

1．1天然产物抗氧化剂的主要类型

1．1．1多酚类物质

1．1．2维生素

1．1．3活性多糖

1．1．4活性肽

1．1．5抗氧化剂与糖尿病、癌症等疾病

1．2 EGCG、葡萄籽原花青素、二氢杨梅素生理活性研究进展

1．2．1 EGCG生理活性研究进展

1．2．2 GSP生理活性研究进展

1．2．3 DMY生理活性研究进展

1．3抗氧化剂的协同作用研究现状

1．3．1维生素的抗氧化协同作用

1．3．2多酚物质的抗氧化协同作用

1．3．3有机酸的抗氧化协同作用

1．4不同抗氧化剂之间的抗氧化相互作用的评价方法

1．4．1直接比较法

1．4．3响应曲面法

1．4．4等辐射分析法

1．5本研究的目的、意义和内容

1．5．1研究目的和意义

1．5．2主要研究内容

1．5．3技术路线

第二章EGCG、葡萄籽原花青素(GSP)、二氢杨梅素(DMY)协同抗氧化作用研究

2．1材料与方法

2．1．1材料与试剂

2．1．2仪器设备

2．1．3 DPPH自由基清除能力测定

2．1．4ABTS自由基清除能力测定

2．1．5羟基自由基清除能力测定

2．1．6不同组合的复合抗氧化物比例设计

2．1．7抗氧化理论值以及协同率的计算

2．1．8数据处理

2．1．9等辐射分析图的绘制

2．2结果分析

2．2．1 EGCG、GSP、DMY的DPPH自由基清除能力

2．2．2 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的DPPH自由基清除能力及抗氧化相互作用关系

2．2．3 EGCG、GSP、DMY的ABTS自由基清除能力

2．2．4 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的ABTS自由基清除能力及抗氧化相互作用关系

2．2．5 EGCG、GSP、DMY的羟基自由基清除能力

2．2．6 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的羟基自由基清除能力及抗氧化相互作用关系

2．2．7用等辐射分析法评价天然产物间抗氧化相互作用关系

2．3讨论

2．3．1等辐射分析法是一种直观的评价天然产物间抗氧化相互作用关系的方法

2．3．2天然产物的抗氧化能力与其结构密切相关

2．3．3不同条件下，抗氧化相互作用存在较大差异

2．4小结

第三章EGCG、葡萄籽原花青素(GSP)和二氢杨梅素(DMY)对糖尿病相关酶的协同抑制作用

3．1材料与方法

3．1．1材料与试剂

3．1．2仪器设备

3．1．4 α-葡萄糖苷酶活性抑制实验

3．1．5 DPP-Ⅳ酶活性抑制实验

3．1．6不同组合的复配物比例设计

3．1．7酶活性抑制率理论值以及协同率的计算

3．1．8数据处理

3．2结果分析

3．2．1 EGCG、GSP、DMY对α-淀粉酶活性的抑制作用

3．2．2 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的α-淀粉酶抑制能力及相互作用关系

3．2．3 EGCG、GSP、DMY对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

3．2．4 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的α-葡萄糖苷酶抑制能力及相互作用关系

3．2．5 EGCG、GSP、DMY对DPP-Ⅳ酶活性的抑制作用

3．2．6 EGCG、GSP、DMY不同比例复配物的DPP-Ⅳ酶活性的抑制能力及相互作用关系

3．3讨论

3．3．1 EGCG、GSP、DMY都具有良好的抑制糖尿病相关酶的作用

3．3．2部分复配组合对糖尿病相关酶的抑制能力有一定的协同增效作用

3．4小结

第四章EGCG、葡萄籽原花青素(GSr)和二氢杨梅素(DMY)对小鼠乳腺癌4T1细胞的协同抑制作用

4．1材料与方法

4．1．1材料与试剂

4．1．2仪器设备

4．1．3小鼠乳腺癌4T1细胞简介

4．1．4小鼠乳腺癌4T1细胞培养方法

4．1．5实验分组

4．1．6 MTT法测定细胞增殖率

4．1．7Annenxin V-FITC/PI检测细胞凋亡

4．1．8数据处理

4．2结果分析

4．2．1 EGCG、GSP、DMY对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和凋亡的影响

4．2．2不同比例EGCG、GSP和DMY复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的影响及其相互作用

4．3讨论

4．3．1三种天然产物可显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和促进4T1细胞凋亡

4．3．2三种天然产物具有协同抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的作用

4．4小结

第五章EGCG、葡萄籽原花青素(GSP)和二氢杨梅素(DMY)复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞的抑制效应与机制研究

5．1材料与方法

5．1．1材料与试剂

5．1．2仪器设备

5．1．3实验分组

5．1．4小鼠乳腺癌4T1细胞培养方法

5．1．5细胞周期检测

5．1．7细胞内活性氧(ROS)水平检测

5．1．8细胞内caspase 3和caspase 9蛋白活性检测

5．1．9细胞内NO水平检测

5．1．10数据处理

5．2结果分析

5．2．1 EGCG、GSP、DMY复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞周期的影响

5．2．2 EGCG、GSP、DMY复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞凋亡的影响

5．2．3 EGCG、GSP、DMY复配物对小鼠乳腺癌4TI细胞内ROS水平的影响

5．2．4 EGCG、GSP、DMY复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞内caspase 3和caspase 9酶活性的影响

5．2．5 EGCG、GSP、DMY复配物对小鼠乳腺癌4T1细胞NO释放水平的影响

5．3讨论

5．3．1各组合天然产物的复配物可显著阻滞4T1细胞周期和促进4T1细胞凋亡

5．3．2各组合天然产物的复配物可通过影响4TI细胞内ROS水平、影响caspase 3和caspase 9蛋白活性等诱导细胞凋亡

5．3．3各组合天然产物的复配物可影响4T1细胞内NO的释放水平

5．4小结

6．1总结

6．2展望

参考文献

作者简历