载阿霉素pH敏感磁性纳米粒的构建及其对乳腺癌4T1细胞的抑制作用研究

摘要

阿霉素(Doxorubicin，DOX)作为白血病、恶性淋巴瘤及乳腺癌等肿瘤的一线化疗药物，可通过进入肿瘤细胞并嵌入DNA分子与之连接，从而抑制DNA的复制与合成，达到抑制肿瘤生长的目的。但阿霉素对正常组织、器官的较大毒副作用限制了其应用。采用现代药剂技术开发新型靶向控释的药物传递系统，可将化疗药物靶向输送到治疗部位并局部控制释放，最大限度地降低毒副作用，提高治疗效果，增加患者的顺应性，是化疗药物减毒增效的重要途径之一。
　　本课题基于介孔硅材料，结合Fe3O4磁性纳米粒和具有pH响应性的高分子材料PEG-b-PAsp等构建出新型功能性复合纳米材料作为阿霉素载体。该复合纳米载体利用介孔硅的有序孔道结构、较大的比表面积和孔容、良好的生物相容性和稳定性、表面易功能化等特点，同时也结合了Fe3O4纳米粒的磁靶向性及pH响应性高分子可对药物控制释放等特性，有望实现阿霉素肿瘤靶向递送和控制释放，达到减毒增效的目的，提高肿瘤化疗效果。
　　本论文的主要研究内容分为四部分:一、复合纳米粒Fe3O4@nSiO2@mSiO2@PEG-b-PAsp@DOX(DOX-NPs)的制备、表征及载药量的优化;二、复合纳米粒对乳腺癌4T1细胞的体外增殖抑制作用研究;三、复合纳米粒对乳腺癌4T1模型的抑制作用研究;四、复合纳米粒对乳腺癌4T1细胞侵袭转移的抑制作用及机制的初步探讨。
　　在第一部分复合纳米粒的构建中，我们通过水热法合成了Fe3O4磁性纳米粒，并通过St(o)ber法和溶胶凝胶过程在磁性纳米粒Fe3O4表面包覆二氧化硅(nSiO2)层以提高Fe3O4磁性纳米粒的稳定性和可修饰性，并在实心硅表面包覆一层介孔二氧化硅(mSiO2)，合成复合载体材料Fe3O4@nSiO2@mSiO2。对该复合载体材料进行表面氨基化处理并连接合成的PEG-b-Pasp高分子材料，利用介孔硅良好的吸附特性及PEG-b-PAsp与阿霉素静电结合能力负载阿霉素，制备出高载药量的磁性介孔二氧化硅阿霉素复合纳米粒Fe3O4@nSiO2@mSiO2@PEG-b-PAsp@DOX。通过正交试验对载药条件进行优化，确定最佳制备条件为C2B1A3D1，即载体材料用量为10 mg、PEG-b-PAsp的用量为4 mg、阿霉素用量为4 mg、加药后的搅拌时间为1h，制备的纳米粒载药量高达58.50％(±3.91％)。室温磁滞曲线及不同pH条件下的释药曲线的测定表明载药复合纳米粒(DOX-NPs)具有良好的磁响应性及pH敏感药物释放特性。
　　在第二部分研究中我们通过生物透射电镜、荧光显微镜等观察，证实载体材料可被4T1细胞有效摄取，并在细胞中释放出DOX，增殖抑制实验表明DOX-NPs具有显著的对4T1细胞的抑制增殖作用，并存在着浓度依赖性，其IC50值为1.284μg·mL-1，与游离药物的体外抑制效果相当。
　　第三部分研究中我们通过小鼠4T1乳腺癌移植瘤模型，以瘤体积和瘤重的变化来评价DOX-NPs体内的抑制肿瘤生长的效果，以肺部表面节结数及转移灶面积为指标来评价其抗转移效果。实验发现DOX-NPs具有显著抑制4T1乳腺癌移植瘤生长的作用，且与游离DOX组相比，小鼠体重减轻较少，表现出较小的毒副作用。DOX-NPs组的肺部表面节结数明显少于其他组，且肺组织HE切片观察到DOX-NPs组的转移灶面积均较其他组小，表明DOX-NPs具有抑制4T1细胞肺转移的效果。
　　基于第三部分研究中发现的DOX-NPs具有抑制4T1细胞肺转移效果，我们对其可能的作用机制进行了初步探讨。通过划痕实验和Transwell实验证实DOX-NPs可抑制乳腺癌4T1细胞的转移及迁移，且随DOX-NPs浓度升高，抑制作用增强。Western Blot的实验结果表明与肿瘤细胞转移相关的细胞黏附因子E-Cadherin的表达量随DOX-NPs处理浓度升高而下降，同时Vimentin的表达量随DOX-NPs浓度升高而升高，因此说明DOX-NPs可以通过抑制或逆转乳腺癌4T1细胞的细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，而抑制乳腺癌4T1细胞的生长和转移。
　　以上结果表明，本课题成功地制备了pH敏感的磁性介孔二氧化硅阿霉素复合纳米粒Fe3O4@nSiO2@mSiO2@PEG-b-PAsp@DOX，在体内外均表现出良好的抑制乳腺癌4T1细胞的生长和转移效果，达到了减毒增效的目的，且初步证实DOX-NPs可抑制或逆转乳腺癌4T1细胞的EMT，在肿瘤治疗领域有潜在的应用前景。

目录

声明

摘要

前言

第一章 复合纳米粒的制备、表征及载药量的优化

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 载体材料(NPs)的制备

2．3 复合纳米粒(Fe3O4@nSiO2@mSiO2@PEG-b-PAsp@DOX)的制备

2．4 纳米粒表征

2．5 载药纳米粒在不同pH缓冲溶液中的药物释放研究

3 结果与讨论

3．1 pH敏感高分子聚合物PEG-b-PAsp的表征

3．2 纳米粒表征

3．3 正交实验结果

3．4 载药量测定结果及pH敏感性释药

4 本章小结

第二章 复合纳米粒对乳腺癌4T1细胞的增殖抑制作用研究

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 乳腺癌细胞4T1对复合纳米粒的摄取

2．3 复合纳米粒的体外靶向性检测

2．4 纳米粒对小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的影响

3 结果

3．1 乳腺癌细胞4T1对复合纳米粒的摄取

3．2 复合纳米粒体外磁靶向性

3．3 CCK-8法及细胞凋亡实验考察纳米粒对小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的影响

4 本章小结

第三章 复合纳米粒对乳腺癌4T1模型的体内抑制作用研究

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2．2 小鼠乳腺癌模型建立与分组

2．3 评价指标

3．1 载体材料的体内毒性评价

3．2 4T1乳腺癌小鼠移植瘤模型的建立

3．3 DOX-NPs的体内摄取情况及抗肿瘤活性

3．3 DOX-NPs的体内抗肺转移活性

4 本章小结

第四章 复合纳米粒对乳腺癌4T1细胞侵袭转移的抑制作用及机制的初步探讨

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料与试剂

2 实验方法

2．1 细胞划痕实验

2．2 Transwell迁移实验

2．3 Western Blot检测E钙粘蛋白和波形蛋白的表达

3 结果与讨论

3．1 细胞划痕实验

3．2 Transwell迁移实验

3．4 Western Blot检测E钙粘蛋白和波形蛋白的表达

4 本章小结

结论

参考文献

文献综述 磁性纳米粒在乳腺癌的诊断与治疗上的应用

致谢

作者简历