MDCK细胞Kca的鉴定及粉防己碱（Tet）对MDCK细胞Kca的影响

摘要

目的：MDCK(Madin-Darby Canine Kidney)细胞钙激活钾通道（calcium-activated potassium channel Kca）的鉴定及探讨粉防己碱对该通道电生理特性的影响。 方法：（1）MDCK细胞传代培养，取单个散在、边缘光滑、折光性适中的细胞，利用膜片钳单通道记录技术，在内面向外式（inside-out）膜片上，利用改变浴液中钾离子浓度和钙离子浓度的方法对通道进行鉴定。（2）在inside-out膜片上记录不同浓度的粉防己碱（Tet）对MDCK细胞Kca的电流幅值(Current Amplitude, Am)、开放概率(Probability of Open, Po)、平均开放时间(Mean Open Time,To)、平均关闭时间(Mean Close Time,Tc)的影响，并对电流幅值的全点直方图(All-Points Histogram)进行函数拟合，结果采用专用软件进行采样和分析。 结果：（1）在对称性高钾溶液([K+]o：[K+]I=140mmolL-1/140mmolL-1，[K+]O为膜外的钾离子浓度，[K+]I为膜内钾离子浓度。)中、inside-out膜片上、膜电位在0mV--+100mV范围内，主要记录到电导为50.475±0.600pS(n=5)的外向通道电流，Am、Po随电压增加而增加，无整流特性。反转电位为0mV。（2）在inside-out膜片上、膜电位在0mV--+100mV范围内、浴液中游离[Ca2+]为10-7molL -1时，浴液中钾离子浓度由140mmolL-1改变为45mmolL-1，在0mV记录到内向电流，反转电位由0mV增加为+30mV，电导为50.275±0.294pS(n=5)。（3）在对称性高钾溶液、inside-out膜片、膜电位+60mV时。在浴液中加入不同浓度的钙离子（0molL-1、10-8molL-1、10-7molL-1、10-6molL-1、10-5molL-1），从10-7molL-1开始，通道活动浓度依赖性增加，Po由0molL-1的0.0096±0.0019和10-8molL-1的0.0110±0.0017分别增至0.0479±0.0020、0.1000±0.0043、0.2400±0.0017，且To延长、Tc缩短，Am变化不显著，洗脱后通道活动完全恢复。（4）在对称性高钾溶液、inside-out膜片上，膜电位为+60mV、浴液中游离[Ca2+]为10-7molL-1时，浴液中加入不同浓度的粉防己碱（Tet）(0molL-1 、7.5×10-6 molL-1、1.5×10-5molL-1、3.0×10-5 molL-1、6.0×10-5 molL-1)，Po分别为0.0500±0.0015、0.0530±0.0010、0.2700±0.0068、0.1200±0.0042、0.0099±0.0012，Am变化不显著，在1.5×10-5molL-1时Po、To最大，Tc最小，在6.0×10-5 molL-1时，Po、To最小，Tc最大。洗脱后，To完全恢复、Tc部分恢复，Po部分恢复，为0.0394±0.0012。 结论：（1）本实验在MDCK细胞上记录到中电导钙激活钾通道（Kca），该通道具有电压依赖性和胞内游离钙离子浓度依赖性，无整流特性。（2）Tet在7.5umolL-1时对MDCK细胞Kca没有显著影响；在15umolL-1时促进MDCK细胞Kca开放，增加钾离子外流；在60umolL-1时抑制MDCK细胞Kca开放，减少钾离子外流。